动物细胞/组织核糖体分离试剂盒产品说明书 主要用途 动物细胞/组织核糖体分离试剂是一种旨在通过物理破壁和化学破膜以及等密度超速离心处理方法，分离出完整而纯化的80S核糖体组分的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种新鲜或冻存的动物和人体细胞或组织胞浆核糖体成分的分离。产品即到即用，操作简易，性能稳定，无核酶和蛋白酶污染，萃取纯度和产量皆高。 技术背景 核糖体（ribosome）是一种细小颗粒的核糖蛋白复合物（ribonucleoprotein complex），生命细胞制造蛋白质的非膜性结构元素和转译装置（translational apparatus），由RNA和蛋白质组成，具有多肽转移酶的活性。其分成2个亚体：大亚体和小亚体。核糖体通过大亚体结合转运核糖体（tRNA），而小亚体结合信使RNA（mRNA），然后阅读RNA提供的信息，转译（translation）成氨基酸，连接成蛋白分子。真核生物的核糖体位于胞浆（游离核糖体）、线粒体和叶绿体中。其中胞浆核糖体为80S核糖体，由40S小亚体和60S大亚体组成：60S由5S RNA、28S RNA、5.8S亚基和49个蛋白组成；而40S由18S RNA和33个蛋白组成。线粒体和叶绿体核糖体与原核生物相似，为70S核糖体，由30S小亚体和50S大亚体组成：50S包括5S、23S RNA和34个蛋白；30S包括16S RNA和21个蛋白。 产品内容 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 分离液（Reagent C） 毫升 保存液（Reagent D） 毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存裂解液（Reagent B）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月 用户自备 HANK平衡盐缓冲溶液（HL12028）或PBS缓冲溶液（HL12033）：用于清理细胞 胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HL12024）：用于细胞脱离 *细胞培养液（HL12052）：用于中和胰蛋白酶的细胞培养基 50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器 15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器 1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器 台式离心机：用于样品操作 超速离心机：用于样品操作 DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞 涡旋震荡仪：用于混匀 实验步骤 实验开始前，将试剂盒里的试剂置于冰槽里冻融备用。然后进行下列操作。 一、细胞核糖体分离 1．准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面 2．分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去 3．重复实验步骤2一次 4．加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面 5．置入37℃培养箱3分种 6．轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落 7．分别加入10毫升用户自备的*细胞培养液 8．移入一个50毫升锥形离心管 9．放入台式离心机离心10分钟，速度为300g 10．小心抽去上清液 11．加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞 12．放入台式离心机离心10分钟，速度为300g 13．小心抽去上清液 14．加入预冷的xx毫升裂解液（Reagent B） 15．涡旋震荡5秒，充分混匀 16．即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器 17．置于冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）（注意：未见组织块） 18．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管 19．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g 20．小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管 21．放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作 22．移取xx毫升分离液（Reagent C）到8毫升超速离心管 23．小心沿着管壁，在分离液（Reagent C）上面，一滴一滴加入4毫升上述获得的后线粒体组分 （注意：避免晃动，同时离心前，使用矿物油填满离心管） 24．小心放进4℃超速离心机离心2小时，速度为260000g 25．小心取出离心管 26．小心抽去上清液 27．加入xx毫升保存液（Reagent D），混匀颗粒群 28．转移到到新的1.5毫升离心管 29．（选择步骤）进行核糖体定量测定 30．放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里准备后续操作 二、组织核糖体分离 1．准备好新鲜或冻存的动物组织，并秤重以确定1至2克组织重量 2．（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管 3．（选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次 4．移入一个液氮冻存管 5．即刻放进液氮罐过夜 6．次日从液氮罐里取出，即刻（快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融） 7．放进一个预冷的15毫升锥形离心管 8．加入预冷的xx毫升裂解液（Reagent B） 9．涡旋震荡5秒，充分混匀 10．即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器 11．置于冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）（注意：未见组织块） 12．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管 13．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g 14．小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管 15．放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作 16．移取xx毫升分离液（Reagent C）到8毫升超速离心管 17．小心沿着管壁，在分离液（Reagent C）上面，一滴一滴加入4毫升上述获得的后线粒体组分 （注意：避免晃动，同时离心前，使用矿物油填满离心管） 18．小心放进4℃超速离心机离心2小时，速度为260000g 19．小心取出离心管 20．小心抽去上清液 21．加入xx毫升保存液（Reagent D），混匀颗粒群 22．转移到到新的1.5毫升离心管 23．（选择步骤）进行核糖体定量测定 24．放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里准备后续操作 注意事项 1．本产品为10次操作（1克动物组织或5 X 107细胞/次） 2．建议使用足够的组织或细胞量 3．样品操作均须在4℃或以下状态下进行 4．操作时，须无菌操作，避免污染母液 5．核糖体定量计算公式（微克/微升）： A260 11.1 6．如果进行核糖体蛋白萃取，建议使用纯化核糖体蛋白质萃取试剂盒—HL16041 7．本公司提供系列核糖体分析技术产品 质量标准 1．本产品经鉴定性能稳定 2．本产品经鉴定分离的核糖体维持正常活性 3．本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶