动物细胞β-半乳糖苷酶活性化学发光法定量检测试剂盒产品说明书 主要用途 动物细胞β-半乳糖苷酶活性化学发光法定量检测试剂是一种旨在使用化学方法，快速有效地裂解动物细胞，通过高速离心，获得澄清细胞裂解悬液，在β-半乳糖苷酶反应体系里，以人工合成的二恶二酮类化合物作为发光底物，水解所产生的发光产物，通过发光探测仪（Luminometer）测定其相对冷光单位（RLU）的变化，以此进行测算酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于基因组学、蛋白质组学和其它分子生物学研究。其适用于转基因后的活体细胞外源性以及衰老细胞内源性半乳糖苷酶活性分析。产品即到即用，性能稳定，参数优化，操作简便、高度敏感。 技术背景 大肠杆菌的标志基因Lac Z编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ； β-gal），在其催化作用下，半乳糖可从乳糖的水解作用中得到。β-半乳糖苷酶非常稳定，对蛋白水解降解作用抗性强，且容易测试。因此β-半乳糖苷酶成为目前常用的报告基因，以评价载体转染的效果。在衰老细胞内，显示β-半乳糖苷酶活性。甲氧基二恶二酮氯代金刚烷苯基吡喃半乳糖苷（3- (4-methoxyspiro [1, 2-dioxetane-3, 2'- (5'-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7]-decan]-4-yl-phenyl -ß-D-galacto pyranoside），是一种二恶二酮（dioxetane）类发光底物，以替代乳糖，在β-半乳糖苷酶（pH7.8）的催化下，去糖基化后，产生二恶二酮，进而在多聚苯甲基乙烷乙烯基苯甲氯化铵和荧光素钠（poly (benzyldimethylvinylbenzyl) ammonium chloride and sodium fluorescein）的启动反应作用下，同时pH调整到12，由此二恶二酮分解，发出冷光，在冷光仪（475nm波长）下，检测发光信号，来测定β-半乳糖苷酶的活性。其发光产物半衰期为10分钟，检测敏感度可达20飞克（fg）。  产品内容 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 稀释液（Reagent C） 微升 反应液（Reagent D） 微升 碱性液（Reagent E） 毫升 启动液（Reagent F） 微升 阴性液（Reagent G） 毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存裂解液（Reagent B）、反应液（Reagent D）和启动液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）和启动液（Reagent F）避免光照；碱性液（Reagent E）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月 用户自备 β-半乳糖苷酶标准样：用于建立β-半乳糖苷酶标准曲线 15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器 1.5毫升离心管：用于样品操作的容器 细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离 （微型）台式离心机：用于样品操作 黑色96孔板或酶标板：用于冷光检测操作的容器 恒温水槽或培养箱：用于反应物孵育 冷光仪：用于样品冷光检测 实验步骤 实验开始前，开启化学发光仪预热，设置波长475nm；开启恒温水槽，设置温度为37℃。同时从－20℃冰箱里取出裂解液（Reagent B）和反应液（Reagent D）等置于冰槽里融化；反应液（Reagent D）和启动液（Reagent F）避免光照。然后进行下列操作： 一、样品准备 1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞） 2．小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面 3．小心抽去清理液 4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化） 5．加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞 6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始） 7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g 8．小心抽去上清液 9．加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀 10．转移到预冷的1.5毫升离心管 11．强力涡旋震荡15秒 12．置于冰槽里孵育30分钟 13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒) 16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作 二、测定准备 1．从-70℃取出上述制备的待测样品，置于冰槽里 2．反应液（Reagent D）和启动液（Reagent F）严格注意避光 3．设定好化学发光仪：温度为30℃预热和运行程序（清洗步骤等）：整合5秒，并置零 4．然后关掉实验室的灯光 三、活性检测 检测开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂置入冰槽里融化；然后移出xx微升稀释液（Reagent C）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升反应液（Reagent D），轻柔混匀后，置于冰槽里，标记为反应工作液，放在暗室里。同时移出xx微升碱性液（Reagent E）到另一新的1.5毫升离心管，加入xx微升启动液（Reagent F），轻柔混匀后，置于冰槽里，标记为启动工作液，放在暗室里。然后进行下列操作。 1．准备1个黑色96孔酶标板，并做好标记：包括背景对照和待测样品 2．分别加入xx微升反应工作液到所有测试孔里 3．加入xx微升阴性液（Reagent G）到背景对照孔里 4．加入5微升待测样品（50微克细胞裂解悬液蛋白）到待测样品孔里 5．轻轻摇动酶标板，混匀 6．室温下孵育60分钟，避免光照 7．分别加入xx微升启动工作液到所有测试孔里 8．轻轻摇动酶标板，混匀 9．室温下静置10秒，严格避免光照 10．即刻放进冷光仪检测：5秒整合检测 11．获得相对发光单位（Relative Light Unit；RLU） 四、样品活性分析 五、样品β-半乳糖苷酶实际活性单位计算（建议使用 β-半乳糖苷酶标准曲线化学发光法测定试剂盒） 1)构建β-半乳糖苷酶标准曲线：横座标（x轴）为每毫升β-半乳糖苷酶单位浓度；纵坐标（y轴）为标准样品读数（吸光单位OD值） 2)根据β-半乳糖苷酶标准曲线，测算样品中含有β-半乳糖苷酶的活性单位（单位/毫克样品） 注意事项 1．本产品为20次操作 2．建议使用核内表达的载体代替胞内表达的载体转染或感染细胞或组织 3．本产品的各项参数达到优化 4．操作时，须戴手套 5．反应液（Reagent D）和启动液（Reagent F）具有光高度敏感性，因此整个操作须避光进行，避免反复冻融 6．测读的所有步骤均须在暗室里进行 7．系统操作过程中，背景测定只需1次 8．用户可以测定细胞裂解悬液的蛋白浓度，便于计算活性单位之需；建议使用 Bradford蛋白质浓度定量检测试剂盒 9．加入启动工作液10秒后，即刻进行冷光测定 10．如果用户没有冷光仪，可以使用闪烁探测器（scitillation counter 或β计数器）替代，但敏感性较低 11．如果是注射式冷光仪，建议测试前后使用无离子水冲洗冷光仪注射（injector）管道 12．相对发光读数RLU（Relative Light Unit）越高，表明酶活性越高 13．测定后，测定杯须清洗* 14．建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升；如果样本酶活性过低，则可以增加样本量 15．用户可以使用β-半乳糖苷酶构建标准曲线，进行样品酶活性单位检测或使用 β-半乳糖苷酶标准曲线化学发光法测定试剂盒 16．本公司提供系列β-半乳糖苷酶检测试剂产品 质量标准 1．本产品经鉴定性能稳定 2．本产品经鉴定检测敏感