组织内质网内钙离子浓度荧光检测试剂盒产品说明书 主要用途 组织内质网内钙离子浓度荧光检测试剂是一种旨在通过内质网钙离子特异性荧光探针Mag-Fluo--AM，与钙离子结合后，其荧光强度显著增强，在荧光分光光度仪下观察相对荧光峰值的变化，来测定内质网中总钙离子浓度的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织（动物、人体等）内内质网钙离子的浓度检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。 技术背景 钙是人体中的一种重要电介质和矿物质，占1150克。其中99％的钙以氟磷灰石钙（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨组织中。非骨组织钙成分主要存在于细胞内。钙具有两种主要形式：一种是非弥散型蛋白结合钙，其构成约40％至50％的血清中的总钙含量；另一种为弥散型游离钙，其进一步分成具有活性的复合钙（complexed calcium）和离子钙（ionized calcium）。钙对神经肌肉兴奋性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、离子跨膜运输、释放神经传导介质、信使传导等方面起着重要作用。在细胞内，钙离子主要储存在线粒体和内质网等细胞器中。其中内质网钙离子储存在控制细胞活化、调控信号通路、蛋白分子转录后修饰，维持细胞内环境钙离子平衡方面起着重要作用。内质网钙的检测包括沉淀法、EDTA鳌合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技术，但容易受到钠、钾、磷酸盐、硫酸盐的干扰，或者受限于仪器的特殊的要求，以及需要内质网纯化。Mag-Fluo--AM染料是一种钙离子低亲和性的荧光标记染料，特异性地由内质网捕获，可以检测内质网内的游离钙离子浓度的变化。在荧光分光光度仪下，激发波长490nm，散发波长525nm，来定量测定内质网的钙浓度。 产品内容 清理液（Reagent A） 　 40毫升 染色液（Reagent B） 　30微升 介导液（Reagent C） 　 600微升 通透液（Reagent D） 40微升 饱和液（Reagent E） 　 2毫升 阴性液（Reagent F） 　2毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存清理液（Reagent A)染色液（Reagent B）介导液（Reagent C）和饱和液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器 细胞培养箱：用于染色孵育 96孔培养板：用于样品操作的容器 荧光酶标仪：用于荧光分析 （共聚焦）荧光显微镜：用于荧光染色观察 实验步骤 一、测定准备 1．设定好荧光酶标仪（22℃）：激发波长490nm，散发波长525nm 2．准备好纯化的内质网样品，置于冰槽里融化 3．测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）室温下融化，然后分别移出　30　微升介导液（Reagent C）和　1.5　微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，标记为染色工作液，并放在暗室里备用。然后进行下列操作。 二、荧光酶标仪检测 1．准备1个黑色96孔板，标记为：内质网样品孔、空白对照孔（不含内质网）、大对照孔（不含内质网） 2．移取100微升纯化内质网样品（100微克）到内质网样品孔里 3．加入100微升饱和液（ReagentE）到大对照孔里 4．加入　100　微升阴性液（Reagent F）到空白对照孔里 5．分别加入　10　微升染色工作液到所有孔里 6．轻轻摇动黑色96孔板，混匀 7．室温下（22℃），孵育30分钟，避免光照 8．放进37℃细胞培养箱里孵育30分钟，避免光照 9．即刻放进荧光酶标仪测读：获得相对荧光单位（relative fluorescence unit；RFU） 10．计算样品内质网钙离子浓度 11．【（样品RFU-空白对照孔RFU)÷（大对照孔RFU-样品RFU)]×22（微摩尔；解离常数）=微摩尔/100微克内质网 　 三、（共聚焦）或荧光显微镜检测 1．取出待测的5至10微米厚的冰冻切片（注意：使用快速冷冻处理－snap frozen的冰冻切片，不宜使用包埋处理） 2．小心加上　500　微升清理液（Reagent A），覆盖切片样品表面 3．小心移去切片样品上的清理液（Reagent A） 4．移取　300　微升清理液（Reagent A）到新的1.5毫升离心管 5．加入　30　微升染色工作液，混匀 6．小心加上上述染色工作液到切片样品上，覆盖切片样品表面 7．室温下孵育60分钟，避免光照 8．小心移去染色工作液 9．小心加上200微升新鲜的清理液（Reagent A） 10．小心加上　2　微升新鲜的通透液（Reagent D） 11．放进37℃细胞培养箱里孵育4分钟 12．小心移去通透液 13．小心加上500微升新鲜的清理液（Reagent A） 14．小心移去清理液 15．小心加上100微升新鲜的清理液（Reagent A） 16．盖上盖玻片 17．即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长490nm，散发波长525nm（内质网钙离子呈现绿色） 注意事项 1．本产品为20次（显微镜）或60次（酶标板）操作 2．操作时，须戴手套 3．避免使用EDTA等处理样品 4．孵育反应完成后即刻进行荧光测定 5．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度 6．检测敏感度可达纳摩尔级钙浓度范围 7．如果荧光淬灭敏感，建议使用抗淬灭剂1 8．可以使用荧光分光光度仪检测 9．本公司提供系列钙生化检测试剂产品 质量标准 1．本产品经鉴定性能稳定 2．本产品经鉴定检测敏感