细胞内氧化应激活性氧超氧阴离子MitoSOX红色荧光测定试剂盒产品说明书

主要用途

细胞内氧化应激活性氧超氧阴离子MitoSOX红色荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂MitoSOX，在线粒体氧化损伤条件下，产生红色荧光，来检测细胞内超氧阴离子活性氧族的生成和增加的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。其中线粒体氧化磷酸化副产物之一是超氧阴离子，为线粒体内主要的活性氧族，与心血管疾病，包括高血压、冠状动脉硬化、糖尿病相关的血管疾病、神经退行性疾病（巴金森氏症、阿茨罕默症、肌萎缩硬化症）相关。MitoSOX是一种*自由通过细胞膜，并选择性在活体细胞线粒体内长期滞留而不外漏的染色剂。一旦被超氧自由基阴离子氧化，便产生荧光。据此证明细胞线粒体内超氧阴离子活性氧族的存在。

产品内容

清理液（Reagent A）    毫升

染色液（Reagent B）    微升

稀释液（Reagent C）    毫升

保存液（Reagent D）    毫升

产品说明书    1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HL12024）：用于细胞脱离

*细胞培养液（HL12052）：用于细胞操作所需的培养基

15毫升锥形离心管：用于细胞操作的容器

1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器

培养箱：用于反应孵育

血细胞计数仪：用于细胞计数

台式离心机：用于样品操作

比色皿或96孔板：用于荧光定量分析的容器

细胞流式仪：用于细胞荧光分析

（共聚焦）荧光显微镜：用于观察荧光细胞

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于细胞荧光定量分析

实验步骤

• 间接法

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent C），混匀后，标记为染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。

• 准备1瓶25cm²细胞培养瓶的待测细胞
• 小心抽去细胞培养液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A）到细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面
• 置入37℃培养箱1分种
• 振动培养瓶，使细胞脱落
• 加入4毫升用户自备的*细胞培养液
• 移入15毫升锥形离心管，充分混匀（注意：悬浮细胞直接从这一步骤开始）
• 移取10微升在血细胞计数仪上进行细胞计数
• 移出1 X 10⁶细胞到新的15毫升锥形离心管
• 放入台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液，轻柔混匀
• 放进37℃恒温水槽孵育20分钟，避免光照
• 放入台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的xx微升保存液（Reagent D），轻柔混匀细胞颗粒群
• 放进冰槽里
• 选择下列方式之一进行操作：
  • 即刻进行细胞流式仪分析：藻红蛋白（phycoerythrin；PE）波段，观察50000个细胞以上――

波峰右移，表明超氧阴离子含量高

• 或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：

1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片

2）激发波长510nm，散发波长580nm――

红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高

• 或使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）：

1）移取400微升上述细胞悬液到1毫升比色皿

2）加入xx微升保存液（Reagent D）

3）上下倾倒混匀数次

4）放进荧光分光光度仪：激发波长510nm，散发波长580nm――

RFU增高，表明超氧阴离子含量高

• 直接法

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent C），混匀后，标记为染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。

1．准备1个细胞培养24孔板的待测细胞，细胞铺满率达70％

（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项5）

2．小心抽去细胞培养液

3．小心沿着孔壁加入xx微升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的

染色工作液到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面

4．放进37℃细胞培养箱里孵育20分钟

5．小心抽去含有染色工作液 

6．小心沿着孔壁加入xx微升37℃预热的保存液（Reagent D）到细胞培养孔

7．选择下列方式之一进行操作：

（A）使用倒置荧光显微镜观察（定性检测）：

激发波长510nm，散发波长580nm――红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高

• 使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）：

放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪：激发波长510nm，散发波长580nm――RFU增高，表明超氧阴离子含量高

注意事项

• 本产品为20次（1毫升体系）或40次（0.5毫升体系）操作
• 操作时，须戴手套
• 孵育时，避免光照
• 本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和各种培养孔板，须相应调整操作用量：

• 根据细胞类型，调整染色工作液使用剂量（1：200至1：1000容量比），避免过度染色
• 建议细胞染色完成后，即刻进行细胞荧光分析
• 本公司同时提供系列超氧阴离子活性氧检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰