Western blot所必须的内参及标签抗体
时间：2022-02-11 阅读：1530
Western blot所必须的内参及标签抗体
——衡量WB成功的标尺
何为内参抗体、何为标签抗体？
一 内参抗体
内参即内部参照（Internal Control），类似于荧光定量实验的内参基因，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由看家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在不同组织和细胞中的表达相对恒定，常用它作为检测目的蛋白表达水平变化时来做参照物。
2内参抗体的选择：
（1） 样本种属来源
哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、NaK、Atpase等。
植物来源实验样本，则可以选择plant actin、Rubisco等。
根据来源样本选择不同的内参，是WB实验成功的关键。也可参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参。
（2）目的蛋白分子量
选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5 KD以上。比如目的蛋白分子量为45 KD，此时不适宜选择β-actin（43 KD）作为内参，可以考虑选择GAPDH或者β-tubulin作为内参。
（3）内参蛋白的表达部位
图1 不同部位内参蛋白展示图
二 标签抗体
标签抗体的组成一般分为蛋白标签和目的蛋白两部分。标签抗体的合成主要是将蛋白标签是利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。标签抗体（Tag Antibody）可用于检测和纯化各种商品化表达载体上的标签序列，分析目的蛋白的表达含量及其功能。其原理是抗原—抗体反应，这些标签抗体可以高度特异地结合对应的标签融合蛋白。
标签抗体的选择可遵循以下原则：
检测蛋白A+His标签，选择抗His抗体；检测蛋白B+MBP标签，选择抗MBP抗体；
标签抗体是开展基因蛋白表达、信号转导和基因功能研究的常用工具。随着技术的不断发展，相继开发得到具有各种不同功能的蛋白标签，常见的蛋白标签有His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP 等。
表1 不同标签功能介绍
融合标签 | 大小（KD） | 功能 | 是否切除 |
HIS | 0.84 | 有利纯化，能纯化可溶性/包涵体蛋白 | 小标签，不影响蛋白功能 |
GST | 26 | 增强可溶性，仅能纯化可溶性蛋白 | 大标签，需切除 |
MBP | 44.4 | 增强可溶性，减弱毒性蛋白 | 大标签，需切除 |
NusA | 55 | 增强可溶性，减弱毒性蛋白 | 大标签，需切除 |
SUMO | 11.2 | 增强可溶性，减弱毒性蛋白 | 大标签，需切除 |
三 翊圣标签抗体与内参抗体
标签抗体
货号 | 名称 | 分子量 | 应用 | WB稀释比例 | 价格（元） |
30503ES20 | Flag-Tag, Mouse mAb | 20μl | IF,WB,IP | 1:1000-1:5000 | 248 |
Flag-Tag, Mouse mAb | 100μl | IF,WB,IP | 1:1000-1:5000 | 748 | |
Flag-Tag, Mouse mAb | 1ml | IF,WB,IP | 1:1000-1:5000 | 3287 | |
Flag-Tag, Mouse mAb | 5ml | IF,WB,IP | 1:1000-1:5000 | 13687 | |
30401ES50 | His-tag, Mouse mAb | 50µl | ELISA, IF, WB, IP | 1:2000-1:20000 | 688 |
30601ES60 | Myc-tag, Mouse mAb | 100μl | ELISA, IF, IP, WB | 1:5000 | 748 |
30701ES60 | HA-Tag, Mouse mAb | 100μl | WB, IP | 1:10000 | 748 |
30901ES50 | GST-tag, Mouse mAb | 50μl | ELISA, WB, IP | 1:5000-50000 | 688 |
内参抗体
货号 | 名称 | 规格 | 应用 | WB稀释比 | 价格（元） |
30101ES50 | β-actin, Mouse mAb | 50 µl | ELISA, IF, WB, IHC, FC, IP | 1:5000-50000 | 688 |
30102ES60 | β-actin, Rabbit pAb | 100 ul | ELISA, IF, WB, IHC | 1:1000-10000 | 998 |
30201ES60 | GAPDH (Clone:1A6), Mouse mAb | 20 µl | ELISA, IF, WB, IHC | 1:10000 | 738 |
30202ES60 | GAPDH, Rabbit pAb | 100 ul | WB | 1:2000 | 588 |
30301ES60 | β-Tubulin, Mouse mAb | 100 µl | IF, WB, IHC ,IP | 1:1000 | 948 |
30302ES60 | β-Tubulin, Rabbit pAb | 100 µl | IF, IHC, IP | 1:5000-10000 | 748 |
30304ES60 | α-Tubulin, Rabbit pAb | 100 µl | WB, IF, IHC, IP | 1:5000-10000 | 948 |
其他常用内参类型推荐
货号 | 名称 | 分子量 | 品牌 |
细胞核膜 | Lamin A/C | 65-75 KD | 代理品牌 |
Lamin B1 | 66-72 KD | 代理品牌 | |
细胞核 | YY1 | 65-70 KD | 代理品牌 |
TBP | 33-43 KD | 代理品牌 | |
Histone H3 | 15-17 KD | 代理品牌 | |
PCNA | 36 KD | 代理品牌 | |
胞浆或全细胞 | GAPDH | 36 KD | 代理品牌 |
β-actin | 42 KD | 代理品牌 | |
Vinculin | 117 KD | 代理品牌 | |
β-Tubulin | 50-55 KD | 代理品牌 | |
α-Tubulin | 50-55 KD | 代理品牌 | |
膜蛋白 | ATP1A1 | 97-110 KD | 代理品牌 |
线粒体 | COX412 | 17-20 KD | 代理品牌 |
COX411 | 17-20 KD | 代理品牌 | |
Porin | 31-37 KD | 代理品牌 | |
全血/血浆/血清 | Albumin | 66 KD | 代理品牌 |
四 标签抗体标记的蛋白纯化产品
1 Anti-Flag亲和纯化凝胶
Anti-Flag亲和纯化凝胶由高质量的鼠源 IgG2b单克隆抗体与Sepharose 4B gel 通过供价偶联制备，本产品具有较高的Flag标签融合蛋白加载容量（至少为1.1mg protein/ml gel），杂蛋白非特异结合少，可用于蛋白质免疫沉淀（IP）和蛋白质纯化。
Anti-Flag亲和纯化凝胶可结合Met修饰的N端Flag融合蛋白（Met-FLAG–Protein），N端Flag 融合蛋白（FLAG–Protein），C端Flag 融合蛋白（Protein-FLAG）。
图2 Anti-Flag亲和纯化凝胶IP后蛋白电泳图
1, 国外品牌 2,Yeasen；抗体浓度：7.5mg抗体/ml凝胶；蛋白结合量：1.25mg蛋白/mL凝胶；蛋白纯度：＞95%
图3 不同品牌Flag凝胶价格比对图
货号 | 名称 | 规格 | 价格 |
20585ES03 | Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag亲和纯化凝胶） | 1ml | 1487 |
20585ES08 | Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag亲和纯化凝胶） | 5ml | 4797 |
20585ES25 | Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag亲和纯化凝胶） | 25ml | 20987 |
20585ES60 | Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag亲和纯化凝胶） | 100ml | 76187 |
2 琼脂糖凝胶偶联标签抗体
琼脂糖凝胶偶联标签抗体由高质量的鼠源单克隆抗体与Sepharose 4B gel 通过供价偶联制备，具有较高的标签融合蛋白加载容量，杂蛋白非特异结合少，可用于蛋白质免疫共沉淀和少量蛋白质纯化。
货号 | 名称 | 规格 | 价格（元） |
20586ES03/20586ES08 | Anti-HA Affinity Gel （Anit-HA亲和纯化凝胶） | 1ml/5ml | 1487/4797 |
20586ES25/20586ES60 | Anti-HA Affinity Gel （Anit-HA亲和纯化凝胶） | 25ml/100ml | 20987/76187 |
20587ES03/20587ES08 | Anti-Myc Affinity Gel （Anti-Myc标签亲和纯化凝胶） | 1ml/5ml | 1487/4797 |
20587ES25/20587ES60 | Anti-Myc Affinity Gel （Anti-Myc标签亲和纯化凝胶） | 25ml/100ml | 20987/76187 |
20588ES03/20588ES08 | Anti-V5 Affinity Gel （Anti-V5标签亲和纯化凝胶） | 1ml/5ml | 1487/4797 |
20588ES25/20588ES60 | Anti-V5 Affinity Gel （Anti-V5标签亲和纯化凝胶） | 25ml/100ml | 20987/76187 |
20589ES03/20589ES08 | Anti-His Affinity Gel （Anti-His标签亲和纯化凝胶） | 1ml/5ml | 1487/4797 |
20589ES25/20589ES60 | Anti-His Affinity Gel （Anti-His标签亲和纯化凝胶） | 25ml/100ml | 20987/76187 |
3 标签多肽
蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。Yeasen公司推出的标签多肽可用于与带有相应标签的蛋白竞争性结合anti-标签单抗，以达到纯化标签融合蛋白的目的。
货号 | 名称 | 规格 | 价格（元） |
20571ES11/20571ES25 | 3X Flag-tag Peptide （3X Flag-tag重复多肽） | 4mg/25mg | 2157/9537 |
20572ES11/20572ES25 | Flag-tag Peptide （Flag-tag多肽） | 4mg/25mg | 1237/5587 |
20573ES08/20573ES25 | c-Myc Tag Peptide（c-Myc Tag多肽） | 5mg/25mg | 1237/5587 |
20574ES08/20574ES25 | HA Tag Peptide（HA Tag多肽） | 5mg/25mg | 1237/5587 |
20575ES08/20575ES25 | V5 Tag Peptide（V5 Tag多肽） | 5mg/25mg | 1237/5587 |
20576ES08/20576ES25 | 6X His Tag Peptide（6X His Tag多肽） | 5mg/25mg | 2557/11837 |
20577ES08/20577ES25 | S-Tag (Pancreatic RNase A derivtive) Peptide（S-Tag 多肽） | 5mg/25mg | 2557/11837 |
20578ES08/20578ES25 | T7 Tag Peptide（T7 Tag多肽） | 5mg/25mg | 2557/11837 |
20579ES08/20579ES25 | VSV-G Tag Peptide（VSV-G Tag多肽） | 5mg/25mg | 2157/9537 |
20580ES08/20580ES25 | X-press Tag Peptide（X-press Tag多肽） | 5mg/25mg | 2157/9537 |
HB200525