干货分享|磁珠常见问题与解决方案

高通量测序技术的跨越式发展，使测序能力大幅上升。在整个NGS工作流程中，磁珠是*的产品。

磁珠通过磁颗粒活性基团在一定条件下可与核酸结合和解离的原理，将样本中目的片段分离。可实现对核酸样本的高通量自动化操作，广泛应用于基因测序以及分子诊断领域。

看起来很简单的纯化/分选实验，却在实际实验中有各种意外的情况。那关于磁珠产品选择和产品使用方面有什么需要注意的事项呢？接下来小翊将从磁珠的外观、储存、应用和使用效果逐一对症分析，希望能帮助大家了解磁珠实验中的那些事。

磁珠外观

Q：如何从磁珠的外观区分磁珠是否正常？

A：正常磁珠静置时，微珠与buffer分层，聚集在瓶身底部，使用前震荡混匀，微珠均匀分布在buffer中。非正常磁珠由于 β-巯基乙醇、DTT、pH差值大等因素，影响磁珠的均一性，使得磁珠粘稠，聚集成块或出现挂壁的现象。

图1：正常磁珠外观图

图2：非正常磁珠外观图

磁珠储存

Q： 不小心将磁珠放到-20℃，但未结冰，是否可以继续使用？

A：不建议使用。因为低温会破坏磁珠的结构，使得磁珠的抓取效率降低，影响磁珠回收性能。

Q：磁珠未开封的时候4℃保存，开封后一直室温保存使用，是否会影响磁珠的回收性能？

A：室温放置对磁珠的回收性能会有一定影响，不建议室温放置太久，使用完后建议4℃保存。PEG分离效果易受pH、温度等影响。

磁珠应用

Q：磁珠分选的原理是什么？

A：第—轮磁珠结合分子量较大的DNA，通过丢弃磁珠去除这部分产物；第二轮磁珠结合剩余产物中分子量较大的DNA，通过丢弃上清去除分子量较小的DNA。

初始样品中的很多组分都会干扰双轮磁珠分选效果。因此，当分选方案执行位置不同时，双轮磁珠使用量也不尽相同。

Q：产品的主要应用是什么？
A：产品主要应用于高通量测序DNA///片段的纯化和分选。对于PCR或者酶切DNA产物的纯化也可以使用。可以有效去除dNTP，引物，引物二聚体，接头，接头二聚体，盐离子等杂质。

Q：产品可以重复使用吗？
A：产品不可以重复使用，乙醇洗脱步骤将影响磁珠表面活性基团性能。

Q：与AMPure XP相比，怎么样？
A：我们的产品制备原材料*进口，可以完美替代AMPure XP Beads。在使用方法，文库大小分布和回收效率上，与AMPure XP Beads*一致，您可以直接按照AMPure XP Beads的操作方式使用，无需摸索条件。

Q： 磁珠可以吸附ssDNA吗？

A：可以回收单链DNA，具体性能没有测试过。附图是Beckman磁珠回收单链DNA的数据，可以作为参考。

图3：XP磁珠回收单链DNA效果图

Q： 分选磁珠可以纯化gDNA吗？

A：翊圣分选磁珠测试过大20kb的片段，回收率>90%。基因组 DNA 未测试过，测试时，由于大DNA与磁珠结合的非常紧，建议尽量增加洗脱液体积，避免干燥时间过久。

Q: 分选磁珠是否可以进行片段产物纯化？

A: 根据客户反馈结果，分选磁珠可以进行片段产物的纯化。0.8×磁珠可以吸附 200 bp 以上的产物，通过去除上清即可对 200 bp 以下的片段进行去除；1.4×磁珠可以吸附 150 bp 以上的产物，通过去除上清即可对 150 bp 以下的片段进行去除。

Q：磁珠的DNA结合能力怎么样？

A：在目前的磁珠体系中，磁珠的吸附能力均为过饱和，客户不必担心磁珠结合能力不足的情况。根据已知的报道，每1 μL磁珠可以结合7 μg DNA。

Q： 使用磁珠吸附小片段的时候，大片段也会吸附上来吗？

A: 磁珠优先吸附大片段，增大磁珠投入量时，磁珠会在吸附大片段的基础上增强吸附小片段的能力。

举例说明：参考磁珠纯化分选表，100 μL样本，加入80 μL磁珠Cat#12601,此时磁珠上吸附的是>350 bp的片段，但是，当磁珠投入量至100 μL时，磁珠上吸附的是>200 bp的片段。

Q：分选磁珠是否可以用于提取DNA？

 A：使用分选磁珠可以实现直接将样本裂解后用磁珠将其中的gDNA提取出来，可能效率没有试剂盒的高，因为我们这款磁珠的定位是在纯化和分选。

磁珠使用效果

Q：使用磁珠分选/纯化之后，还有小片段残留是怎么回事？

图4：二聚体残留效果图

A：小片段残留大部分是接头二聚体（127bp）/引物二聚体（80bp）。若纯化，降低磁珠比例；若分选：可适当降低二轮磁珠比例可有效改善此类情况。

Q：磁珠回收率低可能的原因是什么？

A：1）磁珠与DNA混匀不充分，未能充分吸附。建议反应体系充分混匀；

2）磁珠比例不对，建议按照说明书进行选择合适的比例；

3）孵育时间不足，保证孵育时间至少5 min；

4）磁珠分选时，二轮磁珠吸附的时候吸到磁珠。可在200 μL 枪头前串联 10μL枪头用于移液，可防止吸到磁珠；

5）磁珠洗涤时的乙醇非现配，导致乙醇浓度过低，建议乙醇浓度不低于70%；

6）干燥过度：磁珠长时间干燥导致表面龟裂，DNA难以洗脱，得率降低；建议干燥时间不宜过长，表面刚出现龟裂即可；

7）洗脱液体积不足：终洗脱液应*覆盖管内磁珠。

Q：纯化后DNA在后续实验中表现不理想。
A：由乙醇残留引起，可能是操作时磁珠分离时间过短或磁力器磁力较弱，洗脱步骤中吸取上清速度过快等。建议确保在后一步洗涤结束后，溶液中无残留乙醇。磁珠可于室温干燥5-10分钟，使乙醇*干燥。

Q: 使用 12601 分选磁珠，分选出的文库大小不对称是怎么回事？

图5：分选文库大小不对称效果图

A：操作问题，磁珠比例应严格按照说明书，另外移液时为避免吸到磁珠，底部需残留 1-2μL 液体。

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