定向进化主要包括文库构建与突变体筛选两部分，关键点则在于建立基因型和表型（即突变体性能）之间的物理对应关系。前两期，我们已经介绍了酶定向进化的突变体文库构建技术和突变体筛选技术，今天小翌来介绍基因型与表型的关联。高效筛选方法的前提在于建立可靠的基因型和表型的关联，这涉及两个层面：首先符合预期表型的突变体的基因型可被回溯，即建立氨基酸序列和基因信息之间的联系；其次，突变体相比于亲本的表型变化能被设备或肉眼捕捉，最好能够量化展示突变体性能提升的程度。
突变体的遗传物质和蛋白存在物理联系的关键在于将二者锁定在固定的空间内，酶反应引起的物化性质变化作为筛选的依据，同一空间内的遗传物质则作为突变体酶的分子标签。体内筛选所用的微生物细胞是天然存在的的物理空间，符合期望的表型能直接回溯到相应基因型，并直接获得可持续繁殖的个体。CSR、FADS技术中的微液滴则是在细胞外再构造了一层物理屏障，确保细胞破碎后其DNA和蛋白依然共存。而对于以无细胞反应系统为基础的液滴筛选技术（图1），缺少了微生物这个“内包装”，均相溶液中核酸（mRNA或DNA）和蛋白则只能依赖分子间的相互作用而直接偶联（如依赖嘌呤霉素和嘌呤霉素连接子建立联系），形成类似mRNA-核糖体-蛋白三元复合物的结构，确保酶和相应的核酸一一对应。
另一类方式则是将突变体单克隆预先备份，突变体酶性能评价结束后通过试管编号回溯到相应的种子液，进行再培养和后续测试。而在液滴技术领域，随着设备准确度、速度、智能化程度的提升，液滴编码标记和单液滴分离技术也将可以实现FADS系统中的液滴的备份。
图1. 酶反应过程监测
（图片来自：doi: 10.1016/j.tibtech.2020.01.001）
高效检测让筛选事半功倍！
酶的种类千差万别，不同酶又有多样化的性能提升需求，因此定向进化筛选的标准是需要精确、客观、容易量化的，最重要的是性能变化能直接或间接地被鉴别。
在体内筛选系统中，参与转录和翻译过程的酶蛋白的性能变化能够转化为报告基因的水平差异，如涉及转录的甲基化酶、RNA聚合酶、转录因子（图1c1）、调控因子，涉及翻译的核酶、tRNA及tRNA合成酶。此外，一些转录因子需要与特定的代谢中间产物协同作用（如LacZ和半乳糖、AraC和阿拉伯糖），这些小分子涉及的代谢途径相关酶，也有潜力在报告基因的基础上建立胞内筛选体系。核糖开关是一段特殊的RNA序列，可在小分子的诱导下发生二级结构的改变，这类小分子同样可以关联到特定的代谢途径，以核糖开关下游的报告基因的表达情况指示途径中酶的性能变化（图1c3、图1c4）。
产物是最佳的酶反应标志物，在体外筛选体系中，产物可直接用质谱设备进行定量（图1e），或监测产物积累引起的反应液浊度、pH、电势、荧光强度的变化（图1a&d）。然而，在高通量筛选时体系内的信号常会受到细胞碎片和内容物的干扰，微液滴内极低的产物总量也会对设备的灵敏度带来较大考验。因此，一些特异性识别、标记技术和级联放大策略被用于辅助突变体的筛选。适配体是一段核酸序列（DNA或RNA），折叠为特殊的二级结构即可特异性识别并结合目标分子，甚至通过形成稳定的复合物而激发荧光（图1c5），特征性地被设备识别进而提高检测的特异性和灵敏度。适配体也可以作为RNA聚合酶的反应物，直接指示突变体的活性（图2）。应用于DNA产物检测的标记基团则可通过多种组合方式测试聚合酶、连接酶、限制性内切酶的活性，底物结构或完整度的变化而引起的荧光基团和淬灭基团空间距离的变化，让荧光基团有潜力发出荧光而被设备捕获（图3）。
图2. RNA适配体
（图片来自：doi: 10.1016/j.saa.2022.121760.）
图3. FRET定量检测DNA
（图片来自：doi: 10.1021/acssynbio.9b00103.）
DNA的序列组成决定了酶蛋白的一级结构与催化性能，优势突变体与相应基因型的物理联系则是人们最终破译氨基酸序列的关键。至少在高效、便捷的蛋白质测序技术出现之前，核酸和蛋白的一对一关联对酶的定向进化来说是的。到这，酶定向进化的突变体文库构建技术、突变体筛选技术、基因型与表型的关联已经介绍完了。总之，超高通量筛选对于充分发挥定向进化的潜力至关重要，但目前与高效筛选（即快速、准确、灵敏）相匹配的信号放大策略及设备的开发仍有巨大的提升空间。相信随着酶反应机理及检测技术研究的不断推进，未来定向进化的技术将能够更快实现迭代。
