破骨细胞培养高成功率的关键——高活性RANKL和M-CSF
时间：2023-08-22 阅读：305
图1.破骨细胞分化过程图[1]
在破骨细胞分化成熟的过程中，RANK /RANKL/OPG系统起着分化调控枢纽的作用，是调节破骨细胞分化成熟的关键信号途径。核因子κB 受体活化因子配体（Receptor Activator for Nuclear Factor-κBLigand，RANKL）被认为是促进破骨细胞最为分化成熟及其功能活性最重要的因子，M-CSF可诱导RANK在破骨细胞前体的细胞膜上表达，进而使表达RANK的破骨前体细胞和RANKL结合并产生效应，诱导破骨细胞分化。因此在体外诱导破骨细胞分化过程中RANKL和M-CSF两种细胞因子缺一不可。现在破骨细胞主要采用的诱导法是骨髓单核细胞诱导法和RAW264.7细胞系诱导法。
小鼠骨髓单核细胞诱导
实验方案：
取6-17周龄小鼠，使用CO2吸入或颈椎脱臼致死。用70%酒精消毒小鼠毛皮。
小心地取出股骨和胫骨，并将其放入10厘米的培养皿中。
无菌条件下准备股骨和胫骨：
尽可能使用镊子和剪刀去除所有皮肤、肌腱和肌肉。
用手术刀或剪刀切掉所有骨头的两端。
使用5ml注射器和23-G针头在新鲜培养皿中用10ml破骨细胞培养基从所有骨头中冲洗出骨髓。丢弃已冲洗的骨骼。
使用1ml注射器和27-G针头，通过将细胞悬浮液吸入注射器和从注射器中抽出，尽可能分离细胞聚集体。然后，通过70µm细胞过滤器冲洗细胞悬液，并将其放入50 ml锥形离心管中。
用2ml培养基冲洗细胞过滤器的尼龙网。
获得的细胞悬液300×g，4°C下离心7min，弃上清。
用5ml红细胞裂解液重悬细胞。冰上裂解10min。
离心，弃上清。再用5ml含10%FBS的 α-MEM培养基重悬，离心，弃上清。
用5ml含M-CSF (25 ng/ml）和10%FBS的 α-MEM培养基重悬细胞。接种于6孔细胞培养板中（每只小鼠一孔），置于37°C、5%CO2细胞培养箱中过夜（14至18小时）。
第二天，吸取培养基，收集未粘附的细胞，注意勿刮擦平板底部。将培养基转移至50ml锥形离心管中。300×g，4℃，离心7min，弃上清。
用5ml含10%FBS的 α-MEM培养基重悬细胞，并使用细胞计数装置计数活细胞。
以1×106cells/ml密度接种于培养板上，并加入M-CSF（50ng/ml）和RANKL（25–100 ng/ml）。
3天后更换培养基。第五天左右一般能观察到多核成熟破骨细胞。
TRAP染色鉴定破骨细胞。
注意：
使用的RANKL和M-CSF浓度可能因小鼠和实验室条件而异。
从RANKL和M-CSF添加后的第4天起，每天至少观察一次细胞，因为小鼠破骨细胞在分化后非常不稳定。破骨细胞形成初期，细胞呈纺锤形，成熟后，细胞变大，多核，呈圆形。与人类破骨细胞相反，小鼠破骨细胞在成熟后24小时内死亡。
由巨噬细胞系RAW264.7诱导破骨细胞
实验方案：
用含10%FBS的α-MEM培养基将RAW264.7细胞制成细胞悬液，以3×104 cells/孔的密度接种于24孔板中。
细胞接种12h后，加入RANKL（20-100ng/ml）。
每3天更换培养基，并同时补加RANKL（20-100ng/ml）。
较为明显的多核破骨细胞将在分化培养4天后开始出现，并在第5天至第6天逐渐变得丰富。
进行TRAP染色，鉴定破骨细胞形成情况。
注意：
RAW264.7细胞在含有10%FBS的RPMI-1640或DEME培养基中可以增殖并保持其分化为破骨细胞的能力，而其在含有10%FBS的α-MEM中培养可进行破骨细胞分化试验。
RAW 264.7细胞表达M-CSF及其受体c-fms。因此，仅加入RANKL就足以诱导破骨细胞分化，无需额外加入M-CSF。
（*以上方案供参考，根据实验情况具体优化）
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数据展示
高纯度（>95%）
高活性(Cell based assay）
产品名称 | 货号 | 规格 |
Mouse RANKL | 90630ES08 | 5 μg |
Mouse M-CSF | 91114ES10 | 10 μg |
Human RANKL | 90629ES50 | 50 μg |
Human M-CSF | 91103ES10 | 10 μg |
参考文献
[1]William J. Boyle*, W. Scott Simonet† & David L. Lacey.Osteoclast differentiation and activation.Nature, 423, pages337–342 (2003).