安布罗斯和鲁夫昆的工作证明了microRNA在转录后基因调控中的作用，这是一种全新的基因调控机制。在此之前，科学界的焦点主要集中在转录因子如何作用于DNA，从而决定哪些mRNA被合成，进而控制遗传信息的传递。然而，这两位科学家的发现刷新了我们对基因调控的理解，揭示了microRNA在调节基因表达中的重要性。研究显示，人类基因组中编码了超过1000个的microRNA，这些microRNA在生物界中普遍存在，并在维持基因平衡和细胞功能方面发挥着重要的作用。

microRNA是一类长度约为 22 个核苷酸的小型 RNA，大多数 miRNA 来自非编码 RNA 或内含子，很少有与编码基因外显子重叠，保守的 miRNA (即在脊椎动物中共享) 主要通过经典的 miRNA 途径生成，该途径涉及两个 RNase III 酶：Drosha 和 Dicer。

除了经典的 Drosha/Dicer 途径，还存在一些非经典的 miRNA 途径，这些途径不依赖于 Drosha 或 Dicer。例如：

图.miRNA合成示意图[1]

microRNA研究涉及多个层面，从发现和验证新的microRNA分子，到理解它们的功能和机制，再到可能的治疗应用。以下是一些microRNA研究中的常见问题和相应的解决方案：

目前定量分析miRNA的方法中最为常用的是荧光定量PCR。但是miRNA本身相对较小，传统的RNA提取、反转录和定量方法难以高效的保证miRNA的检测，选对适配的方法此时则显得尤为重要。

传统的有机提取通常提取的是较大分子量的RNA，例如mRNA和核糖体RNA，但对于miRNA的提取效果则不太理想，可能是由于小分子量的miRNA不易被醇类沉淀。针对这个问题，翌圣匠心研发了专门针对miRNA提取的产品-MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit 细胞/组织miRNA提取试剂盒。

采用MolPure® RNA Column M1和microRNA Column M1以及新型的溶液体系，适用于从多种新鲜或冻存的动物组织或培养细胞中快速提取各种小RNA。试剂盒内的MolPure® RNA Column M1可选择性吸附核酸，不吸附蛋白质、多糖和其它非核酸类物质；microRNA Column M1则能从总RNA中有效富集到15-30 nt左右的小RNA（包括siRNA和miRNA）。

成熟的miRNA的长度只有20nt左右，通常正向引物就会覆盖其全长甚至会有多余部分，反向引物就无处安置了。目前市面上解决方案就是在反转录时设法增加反转录产物长度。常见的方法有加尾法和茎环法。

加尾法利用PolyA 聚合酶为成熟的miRNA加上Poly(A)尾，以带有通用序列的Oligo-dT作为反转录引物，合成加长的miRNA对应cDNA第一链。茎环法以折叠为茎环结构的通用序列作为引物合成加长的miRNA对应cDNA第一链，后续扩增过程中，茎环结构在适宜的温度下会被打开，和相关扩增引物结合。

图. 加尾法合成miRNA

图.茎环法合成miRNA

11148ES-Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

试剂盒采用加尾法来进行miRNA第一链cDNA的反转录，产品中的2×Hifair® miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反应和反转录反应的所有原料和引物，并经过精心优化，可保证miRNA 3‘末端的Poly(A)修饰过程和反转录过程同时高效进行。

11171ES -Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。DNA 聚合酶采用化学修饰的热启动聚合酶，配合特殊的Buffer体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内进行准确定量。

图. 人类hsa-let-7家族拥有多条miRNA，彼此间相差的碱基很少，甚至只有单碱基的差异。每个Let-7亚型（hsa-miR-let-7a~Let-7i，has-miR-98）的人工合成miRNA使用 Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录合成cDNA，以不用的引物，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分别扩增这些miRNA，利用公式2-ΔCT x 100%计算匹配率。结果显示，可有效区分密切相关的亚型家族成员。

图. 以人293T细胞和鼠源肝脏Total RNA为模板，扩增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。结果显示，与同类产品相比，Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)配套 Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)的反应体系，具有优异的表现。

11139ES-Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

该试剂盒基于Hifair® III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快，且热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的反转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的反转录。Hifair® III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可合成长达19.8 kb的cDNA。

11170ES-Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行miRNA定量反应的专用预混液。由于miRNA序列短，且同一家族的miRNA序列往往高度相近，故在定量时对特异性要求高。本品基于热启动的 DNA 聚合酶，配以优化的Buffer，能够极大地减少非特异性扩增；同时，特殊的ROX Reference Dye，使得预混液适应于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。

图.以小鼠肝脏细胞的Total RNA为模板，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）进行反转录，获得的cDNA稀释40倍后，用Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分别扩增人源的mmu-miR-125a基因。

图.以小鼠肝脏细胞的Total RNA为模板，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）进行反转录，获得的cDNA 以10倍梯度稀释（范围10pg /μL-0.1μg /μL），扩增鼠源的mmu-miR-125a、mmu-miR-132、mmu-miR-351基因。

图. 人类hsa-let-7家族拥有多条miRNA，彼此间相差的碱基很少，甚至只有单碱基的差异。以不同的引物，使用 Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分别扩增这些miRNA，利用公式2^-△ct x 100%计算匹配率。

图.以人293T细胞的Total RNA为模板反转录，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）进行反转录，获得的cDNA稀释50倍，使用Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）进行90孔平行重复实验扩增人源的hsa-let-7a基因。

[1] Shang R, Lee S, Senavirathne G, Lai EC. microRNAs in action: biogenesis, function and regulation. Nat Rev Genet. 2023;24(12):816-833. doi:10.1038/s41576-023-00611-y