用于iPSC细胞培养的层粘连蛋白包被实验方案-技术文章-翌圣生物科技（上海）股份有限公司手机版

用于iPSC细胞培养的层粘连蛋白包被实验方案

时间：2024-10-18 阅读：137

层粘连蛋白521（Laminin 521）背景

层粘连蛋白521（LN521）是天然干细胞生态位的关键细胞粘附蛋白，是一种用于人胚胎（hES）和诱导多能干细胞（hiPSC）培养和扩增的基质。LN521与细胞表面受体结合，激活细胞信号通路，从而产生更多功能性细胞。

Laminin 521在体外重现生物学相关的hPSC环境，促进hPSC的附着、高存活和强大的长期自我更新，是支持干细胞生长以及维持基底膜结构和性能稳定的关键基质蛋白。Laminin 521也是目前常用的无滋养层培养基质之一。此外，Laminin 521无需添加任何细胞凋亡抑制剂，即可实现遗传稳定和多能干细胞的高效单细胞传代，细胞以均匀单细胞层生长，无需手动去除任何分化区域。另外，研究表明LN521可支持PSC生长超过10代，且无任何核型异常迹象，并且保持PSC分化为内、中、外三个胚层的能力。

图1.Laminin 521结构[1]

层粘连蛋白包被实验

用无菌去离子水或注射用水将层粘连蛋白521配制成400µg/ml。建议使用前用无菌1×DPBS（Ca++/Mg++）进一步稀释至100µg/ml，然后用无菌DPBS（Ca++/Mg++）稀释至工作浓度5-10µg/ml。包被浓度因培养细胞类型而异，建议实验方案优化以确定细胞的最佳包被浓度。推荐浓度请见表1。

注意：

应使用含有Ca2+和Mg2+的DPBS，因为二价阳离子对蛋白质的结构和功能很重要。

Laminin 521 所需的工作浓度取决于细胞和应用。我们建议初始包被浓度为0.5μg/cm2。

表1. 不同培养容器的推荐重组人层粘连蛋白工作液的加入量

培养皿	包被浓度（μg/mL）	LN521加入量	1*DPBS加入量	总体积
6孔	5	50 μL/孔	950 μL/孔	1 mL/孔
12孔	5	25 μL/孔	475 μL/孔	0.5 mL/孔
24孔	5	15 μL/孔	285 μL/孔	0.3 mL/孔
48 孔	5	7.5 μL/孔	142.5 μL/孔	150 μL/孔
96孔	5	3.5 μL/孔	66.5 μL/孔	70 μL/孔
35mm培养皿	5	50 μL/孔	950 μL/孔	1 mL/孔
60mm培养皿	5	100 μL/孔	1900 μL/孔	2 mL/孔
100mm培养皿	5	300 μL/孔	5700 μL/孔	6 mL/孔

*以上体积以5μg/mL包被浓度为例

将体积的层粘连蛋白-DPBS混合物加入每个孔中，轻轻摇晃。确保整个表面都被层粘连蛋白包被溶液覆盖，为未涂层的表面不支持细胞生长。

将板子放入37°C培养箱中孵育过夜，最短孵育时间为2小时，但建议过夜培养以获得理想的细胞培养条件。注意不要让培养容器干燥，会使LN521失活。

当细胞准备好接种时，吸出层粘连蛋白521溶液。

iPSC 培养

ipsc解冻（以12孔板为例）

1.1 将 iPSC 从液氮或干冰中取出，在 37°C水中解冻10 秒。

1.2 用75％酒精对冷冻管进行消毒，并将其转移到工作台面上。

1.3 将细胞转移到一个新15 mL离心管中，离心管中含有9 mL DMEM‑F12。

1.4 将15 mL离心管在室温下以300g离心5min。

1.5 将已包被好的12孔板中的层粘连蛋白溶液弃去。

1.6 弃去细胞上清液，用1 mL mTeSR-plus（含10 µM Y-27632 ）轻轻重悬 iPSC，然后将其转移到已包被好的12孔板中。摇动板以均匀分布细胞，最终细胞密度为1×10^5细胞/孔，静置，室温下放置10分钟。确保培养在4~5天内传代。

表2.不同培养容器的细胞接种密度，根据细胞的生长速度确定细胞数量

细胞培养容器	6孔	12孔	24孔	96孔
细胞数量	2.5~3.5×105	6~8×104	3~4×104	0.5~1×104

1.7 将12孔板放回37°C培养箱孵育。

1.8 含ROCK抑制剂的培养基应在12~16小时后除去，继续在不含抑制剂的培养基中培养。

ipsc传代方案

2.1 弃去培养上清，用1 mL PBS(Ca‑‑/Mg‑‑)冲洗。

注意：使用不含Ca2+ 和 Mg2+的PBS，因为二价阳离子对某些解离酶有负面影响。

2.2 弃去PBS，加入0.5 mL Gentle Cell Dissociation Reagent。室温下放置6-8分钟或放在显微镜下观察，直至细胞不再结合到板上。

2.3 加入等体积的DMEM-F12，轻轻混匀细胞，在室温转移到离心管中，以300g离心5min。

2.4 在传代细胞前，准备一个层粘连蛋白包被的12孔板。

2.5 弃去上清液并用含有 10 µM Y‑27632 的 mTeSR‑plus 培养基重新悬浮细胞。

2.6 将细胞转移到准备好的层粘连蛋白包被的12孔板中。轻轻摇动板以均匀分布细胞，并室温下放置10至20分钟。

2.7将12孔板放入37℃培养箱中孵育。

注意：ipsc长成单层后会迅速分化并死亡。为了保持生长和多能性，需在其长满前进行传代。

ipsc的冷冻保存

3.1 准备好温和细胞解离试剂。
3.2 按照ipsc传代方案进行细胞分离，使用细胞器计数，确保冷冻保存前的细胞密度。
3.3 每管细胞应以1-2×10^6细胞密度冻存。按照ipsc传代方案中，离心、取出细胞培养基的步骤进行。将分离的iPSC沉淀重悬于适当体积的冷冻保存液中。
3.4 将1 mL 重悬的细胞冷沉淀加入1.5mL冻存管中，进行程序降温，然后转移到到液氮中，长期储存。

层粘连蛋白包被的重要注意事项

1.实验方案中的所有步骤均须在无菌条件下执行。
2.避免层粘连蛋白长时间暴露在室温下。
3.应避免反复冻融
4.解冻后，未稀释的蛋白原液在无菌条件下储存于 2~8℃保存，可稳定保存至少3 个月。