【小翊实验手帐】The Choice of RT-qPCR：One-step or Two-step

作为一个进实验室不久的实验小白，zui近实验室师兄新购买了一步法定量试剂，而我一直使用的是“先反转录再定量”，那一步法定量试剂又是什么鬼？

为了跟上大师兄的脚步，不拖实验室后腿，我学习总结了以下材料。

实时定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，即qRT-PCR或qPCR），是对基因和基因转录水平（即RNA）定量的重要方法。对于RNA的定量，需反转录（Reverse Transcription，即RT）和定量（qPCR）两个过程。

根据实验操作步骤的不同，可分为：One-step RT-qPCR、Two-step RT-qPCR。

One-step RT-qPCR

实验过程：RT与qPCR在同一个反应管中，可实现对RNA的直接定量。

实验方法优点：1、多样本基因定量：在市面上的预混液（如师兄买的小翊家的One-step RT-qPCR SYBR^® Green Kit）基础上，配制含待测基因上下游引物的Mix，即可实现对不同待测样本同一基因的检测。2、污染几率低：较少的加样次数，有效降低体系配制过程中组分污染的几率；3、操作简便，节省时间。

考虑到RT和qPCR均是酶促反应，核心酶是Reverse Transcriptase和DNA Polymerase。而两个酶促反应在同一体系下进行，必然会牺牲其中之一的性能，因此该方法存在以下缺点：1、RT过程：①对模板RNA质量要求高：RNA质量的优劣严重影响逆转录效率；②模板使用量较大：一步法qRT-PCR使用基因特异性引物，而两步法qRT-PCR的RT过程使用Oligo dT和Random Primerzui适比例混合液作为引物，就反转录产物量而言，基因特异性引物低于Oligo dT和Random Primer；③易造成引物二聚体的形成：在37-50℃条件下，上下游引物3’末端易发生退火，而Reverse Transcriptasezui适酶活温度恰恰多为37-50℃。2、qPCR过程：①若为染料法定量，引物二聚体会干扰定量结果；②DNA聚合酶酶活受到逆转录体系中某些组分的抑制，影响扩增效率。

精明的科学家们通过对RT Enzymes和DNA Polymerase结构改造，优化酶反应离子环境，减少抑制成分，实现RT和qPCR反应均以足够大的效率在同一体系中进行。

Two-step RT-qPCR

图3.两步法RT-qPCR反应体系与过程

对于绝大多数同学来讲，是进入实验室学到的zui基础zui经典的实验技术。实验过程是：先RT，后qPCR，通过定量cDNA，对RNA间接定量。

实验方法优点：RT过程：1、RNA要求宽泛：大多数RT Enzymes可使用1ng-1μg起始模板量总RNA率逆转录（实验室常买的是小翊家的Hifair^TM RT Enzymes可兼容1pg-5μg起始模板量总RNA）;2、应用广泛：cDNA可用于文库构建或基因克隆等。qPCR过程：1、扩增效率高：RT过程产生的cDNA，可经5-20倍稀释，zui大程度上减少对定量反应的抑制；2、高通量多基因定量：逆转录得到cDNA样品，可同时实现多个基因检测。

该方法将RT和qPCR两种酶促反应分开进行，更便于RT Enzymes和DNA Polymerase酶活性的释放。但分步操作会耗时较长、需多次加样移液，可能会增大产生误差和交叉污染的几率。

One-Step or Two-Step？

我统计了两种方法的特点及应用，以备后续实验时，更好的选择定量方法。

附小翊家的产品：

One-step RT-qPCR SYBR^® Green Kit：Cat.1125

Hifair^TM RT Enzymes：Cat.1110、11111