凋亡早期检测

——Annexin-V呈现检测结果

一 背景介绍 

细胞凋亡（Apoptosis）一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡过程。 细胞凋亡途径中各事件的发生是有时序性的，即各事件按先后顺序依次发生，zui终导致凋亡小体的出现，细胞随后发生凋亡。

凋亡早期

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（Phosphotidylserine, PS）位于细胞膜内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS由细胞膜的内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36 kDa的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合，通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

检测方法：用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的 Annexin-V 作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。另外，碘化丙啶（propidine iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

使用反馈

荧光补偿的调节：

Q：光补偿调节的原则？

A: 1）用于调节补偿的样本必须单染。

2）用来调节补偿的荧光素必须与实验用的荧光素一样（例如不能用FITC调节EGFP的补偿）。

2）横平竖直：理论上X-Mean或者Y-Mean要相等（如下图所示），但在实际操作中，只需要保证单染的细胞不跨区存在。

Q：如何进行光补偿的调节？ 

A：进行荧光补偿的调节，需要设置几组对照实验。以AnnxinV-FITC/PI双染试剂盒为例；

1）空白对照组：不进行任何标记的细胞，用于电压的调节，调整前向散射和侧向散射，得到清晰划分的细胞群体。

2）凋亡诱导的单染组：阳性对照的细胞群体需要超过分析的细胞群体的10%，用于调节补偿。 

3）双染实验组：利用空白对照组和单染组调节好的参数进行实验数据的获得。

订购信息：

三 常见问题与解答

Q：Annexin V/ PI 试剂盒能否检测除人以外其他动物细胞凋亡情况？

A：可以。因为Annexin V 是与磷脂酰丝氨酸（PS）的结合，而PS不存在种属间差异。

Q：使用Annexin V/ PI 试剂盒进行凋亡检测，用含EDTA 的胰酶消化细胞对结果有影响吗？

A：会。因为Annexin V 是Ca²⁺ 依赖的蛋白，EDTA会 螯合Ca²⁺从而影响Annexin V与PS 的结合，进而影响实验结果。

Q：如果细胞自带GFP蛋白，请问哪种凋亡检测试剂盒适用该细胞的凋亡检测？

A：选用PE标记或者APC标记的Annexin V凋亡检测试剂。

Q：对于来自血液的细胞样品，为什么去除血液中的血小板？

A：因为血小板中含有PS，其能与Annexin V结合进而干扰实验结果。

Q：Annexin -V 在实验操作上应注意哪些事项？

A：由于Annexin -V上带有荧光基团，实验上应尽量避光操作和孵育；为保证实验结果的正确性应在染色后1h内上机检测。

四 部分使用客户已发表文章

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