一步法同源重组
时间：2017-09-07 阅读：4249
不让您宝贵的克隆留下“疤痕”！
提起传统酶切连接克隆或载体构建，什么让大家苦不堪言？
小A：每次都要纠结于各种限制性内切酶的选择。 
小B：操作步骤繁琐，耗时长，至少需三四天才能完成。
小C：每次只能克隆1个目的片段。
小D：片段结合位置上有时会留下“疤痕”。
······
忘记苦难，今天小编给大家介绍一种新的克隆方法—一步法同源重组技术，带你们脱离苦恼！
一步法同源重组是一种利用同源重组的原理，进行无缝克隆的技术。该技术无需考虑酶切位点，几乎适用于任何载体与任何片段的定向克隆。操作过程简单快速，只需50℃，20min即可完成反应。劲爆的是，多个片段也可以同时克隆哦！
激动宝宝小C：如此厉害，是如何做到呢？
【秘】一步法同源重组的关键在于重组酶。它由三种酶混合而成。分别是外切酶，DNA聚合酶和连接酶。
外切酶活性：该酶能沿着5’→3’方向，降解双链DNA，从而产生黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合（两个同源序列通过外切酶的切割，能产生几乎一致的黏性末端）。
DNA聚合酶活性：外切酶作用后，并不能保证将每一个片段的5’末端都降解成一样长的黏性末端，同源末端退火配对后，极可能存在缺失的碱基。此时需要借助DNA聚合酶进行修复缺口。
连接酶活性：催化形成磷酸二酯键，将所有缺口补齐，实现无“疤痕”拼接，即无缝克隆。
好奇宝宝小D：外切酶降解双链DNA多长呢？是否会把双链DNA切割成单链导致无法进行片段重组呢？
莫担心，自有妙招！的重组反应温度是50℃，远高于外切酶的zui适温度（37℃），此外，外切酶的含量较低，故重组反应体系中很快会失去外切酶活性。对于200bp以上的双链DNA-片段都是*不用担心的，当然，几十bp的小片段是不适合同源重组的。
心急宝宝小B：这么牛掰的，快给我们讲讲怎么操作吧。
步骤1：制备载体
需将线性化载体的制备好，既可以选择酶切，也可以选择PCR的方式制备线性化载体。
步骤2：设计目的片段引物
在目的片段上下游引物的5’端引入15-25bp左右载体末端同源序列。
步骤3：扩增目的片段
通过PCR的方法，使目的片段的两端加上了与载体末端相应的同源序列。
步骤4：重组反应
按比例混合线性化载体和目的片段，50℃反应20 min。
步骤5：转化，鉴定
将重组产物直接转化后涂平板，挑取克隆进行阳性鉴定。
机智宝宝小A：有啥应用呢？
可以应用于定点突变，CRISPR，构建多顺反子表达载体等等。
看完有收获，记得点完赞再走！
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