进行基因功能研究时，如能包含信号通路无疑会提升故事的深度和完整性。研究信号通路很重要的一个手段是过表达基因，观察表型变化。今天就向大家介绍一个过表达基因的技术——过表达载体的构建。下面就从目的基因调取、引物设计、过表达质粒构建详细说明。

以人pyrin基因、pWPI-eGFP过表达质粒为例，构建慢病毒过表达载体pWPI-eGFP-pyrin。

一、pyrin基因序列的调取

进入NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），

选择pyrin种属来源，如人

选择基因亚型，需查阅文献（根据实验需求，并查阅文献发现pyrin亚型1与研究目的一致）

点击NM 000243.2，查找到基因pyrin的CDS区，

二、克隆方法的选择

n 粘性末端克隆法

该方法需要在目的基因pyrin引物的5’端加上酶切位点，方法如下：

1. 酶切位点选择

1）pWPI-eGFP质粒中带有启动子EF-1α（与CMV启动子类似），双酶切可选择SwaⅠ与PmeⅠ或PacⅠ与PmeⅠ。注意不要选SwaⅠ与PacⅠ，因为双酶切时两个酶切位点的距离应相差在9bp以上。在这里，我们选用PacⅠ与PmeⅠ双酶切距离说明。

2）双酶切时，需要在酶切位点前面加上保护碱基，以保证*的酶切效率。选取酶切效率zui高的保护碱基。

2. pyrin基因的引物设计

以PacⅠ与PmeⅠ双酶切为例，pyrin基因的上下游引物为

3. 设计好引物后，PCR扩增pyrin基因，跑胶回收PCR产物，PacⅠ与PmeⅠ双酶切pWPI质粒和pyrin基因，回收酶切产物，连接转化即可。

4. 挑取单克隆，验证，获得阳性克隆。

粘性末端克隆获得的重组质粒可用于瞬转，研究基因功能。但是，要长时间稳定过表达基因，就需要慢病毒包装，此时pWPI-eGFP中的cPPT/CTS需要保留，那么PmeⅠ就不适合进行酶切载体。此时就需要另外一种克隆方法——一步法克隆。

n 一步法克隆法

该方法需要在pyrin基因引物的5’端添加与pWPI载体末端相同的重叠序列，具体做法如下：

1. 酶切位点的选择

根据慢病毒包装的要求，pyrin基因需要插入在cPPT/CTS位点前面，此时载体的线性化可以通过SwaⅠ或PacⅠ单酶切实现。

2. pyrin基因的引物设计

1）重叠序列大小为15-20bp，酶切位点不计算在内；2）以PacⅠ单酶切为例，pyrin基因的上下游引物为：

3. 设计好引物后，PCR扩增pyrin基因，胶回收产物与载体酶切回收产物发生重组反应。

4 挑取单克隆，验证，获得阳性克隆。

三、质粒构建成功后，转染细胞，观察是否表达。若进行稳转，后续还需使用该重组质粒包装慢病毒。

四、注意事项

1、可通过GFP蛋白的表达情况，观察转染效率。若转染效率较低，可通过抗生素筛选，提高整合基因到基因组的细胞的纯度。因pWPI-eGFP质粒不带有哺乳动物细胞药物筛选基因，因此可以通过流式细胞术筛选，获得带有GFP阳性的细胞，使整合基因到基因组的细胞纯度提高。

2、还可以通过有限稀释法获得单个阳性克隆的细胞，避免在细胞传代过程中，由于细胞不断分裂，过表达的效果不断减弱造成的表型不明显现象的发生。

3、本案例较为特殊，对于其他过表达载体构建或慢病毒包装而言，一步法克隆方法与粘性末端克隆方法或许均可使用。

HB170904