HB180502

TRITC Phalloidin 罗丹明标记鬼笔环肽

产品信息

背景描述

鬼笔环肽（Phalloidin）是一种来源于毒蕈类鬼笔鹅膏（Amanita phalloides）的环状七肽毒素，以高亲和力（Kd= 20 nM） 选择性结合于丝状肌动蛋白 F-actin，而不会与单体肌动蛋白 G-actin 结合，通常用来标记组织切片，细胞培养物或无细胞体 系中的 F-actin，从而对 F-actin 进行定性和定量分析。另外，鬼笔环肽衍生物也以相近的亲和力结合于大小纤维，无论是动 植物来源的肌肉细胞或非肌肉细胞，按照每一个肌动蛋白亚基约与一个鬼笔环肽分子的计量比结合。且非特异性结合几乎可 忽略，染色区域和非染色区域辨识度非常明显。因此，鬼笔环肽衍生物特别适合替代肌动蛋白（Actin）抗体进行相关研究。 另外鬼笔环肽衍生物很小，直径约 12-15Å，分子量＜2000 Daltons，未标记肌动蛋白（Actin）的许多生理特性都得以维持， 比如，同肌动蛋白结合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I 等仍能发生反应；鬼笔环肽标记的纤维丝仍可穿透固相肌球 蛋白基质；以及甘油抽提的肌纤维标记后仍可收缩等。

鬼笔环肽（Phalloidin）的结合阻止丝状肌动蛋白（微丝）的解离，稳定微丝结构，从而破坏微丝的聚合-去聚合的动态 平衡。此特性使得肌动蛋白聚合发生的临界浓度（CC）降至＜1 µg/mL，因此，可用作一种聚合促进剂。此外，鬼笔环肽还 可抑制 F-actin 的 ATP 水解活性。

本品为 TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）标记的鬼笔环肽，染色反应特异性强，对比性高，具有比 Actin 抗体更好的染 色效果，适合用作 F-actin 的定性和定量检测。另外，经本品结合后的 F-actin 仍能维持 actin 自身具有的许多生物学特性。 且本品的结合没有物种差异性，适用性广泛。

我司分别提供冻干粉形式（货号：40734ES80）和储存液形式（货号：40734ES75，浓度为 20 µM）的 TRITC 标记鬼笔 环肽，用户根据自身需求选择。建议使用浓度为 80~200 nM。

产品性质

运输与保存方法

冰袋运输。-20℃避光干燥保存， 1年有效。

注意事项

1） 鬼笔环肽具有毒性，需小心操作（对人的半数致死剂量 LD50 约 2 mg/kg）。

2） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

需要自备材料

1） （可选）甲醇

2） 1×PBS 缓冲液, pH 7.4, 细胞培养级别（货号：60145ES76）

3） 固定液 4%多聚甲醛（溶于 PBS 缓冲液）（货号：36314ES60）

4） 丙酮或透化液 0.5% Triton X-100（溶于 PBS 缓冲液）

5） Fluoromount-GTM   水溶性封片剂（不含 DAPI）（货号：36307ES08），DAPI（货号：40727ES10）

6） （可选）DAPI Fluoromount-GTM  水溶性封片剂（含 DAPI）（货号：36307ES08）

7） （可选）BSA，标准级别（货号：36101ES25）

8） 载玻片和盖玻片

9） 盖玻片周围密封液（如透明指甲油）

10）组装有 TRITC 激发/发射滤片，以及 DAPI 激发/发射滤片的荧光显微镜或共聚焦显微镜。

操作步骤

1.工作液准备

1）对于 TRITC 标记鬼笔环肽（货号：40734ES75，300T）

本品以溶于甲醇的 20 µM 储存液形式提供，总量为 300 µL。按照 100 nM 的工作液浓度来换算，可制备总量为 60 mL 的工 作液。建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，-20℃避光冻存，一年稳定。

开始实验前，使用 1×PBS 缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为：80~200 nM。工作液现配现用。

2）对于 TRITC 标记鬼笔环肽（货号：40734ES80，1mg）

本品以冻干粉形式提供，分子量为 1231.4，总量为 1 mg。可先用甲醇或者 DMSO 充分溶解配制成 20~100 µM 的储存液。 如，加入 8.1208 mL 甲醇到 1 mg 鬼笔环肽即得到 100 µM 等量的储存液，根据单次使用量，进行小量分装，-20℃避光冻 存，一年稳定。

开始实验前，使用 1×PBS 缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为：80~200 nM。工作液现配现用。

2.染色步骤

1）细胞爬片生长 24 h，使其密度达到 50%汇合度。

2）吸掉培养液，37℃预热的 1×PBS（pH 7.4）清洗细胞 2 次。

3）使用溶于 PBS 的 4%进行细胞固定，室温固定 10 min。

【注】避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。

4）室温条件下，用 PBS 清洗细胞 2~3 次，每次 10 min。

5）室温条件下，用丙酮（≤-20℃）脱水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化处理 5 min。

6）室温条件下，用 PBS 清洗细胞 2~3 次，每次 10 min。

7）取 200 µL 配制好的 TRITC 标记鬼笔环肽工作液，覆盖住盖玻片上的细胞，室温避光孵育 30 min（通常情况下，4℃~37℃ 孵育皆可）。

【注】为了降低背景，可于 TRITC 标记的鬼笔环肽工作液内加入 1% BSA；另外，孵育过程中为了避免溶液挥发，可 将盖玻片转移到一个密封的容器内。

8）用 PBS 清洗盖玻片 3 次，每次 5 min。

9）使用 200 µL DAPI 溶液（浓度：100 nM）对细胞核进行复染，约 30 s。

10）用 PBS 清洗盖玻片，然后倒置在已经滴有一滴 Fluoromount-GTM 水溶性封片剂的载玻片上。使用纸巾轻轻檫掉多余封 片剂，然后用指甲油*封片。此法制备的标本玻片可置于 4℃避光保存，通常 6 个月内可继续做 F-actin 染色分析。

【注】也可以直接使用含有 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂（货号：36308ES11）合并步骤 9）10），简化步骤。

11）荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察，选择 TRITC 激发/发射滤片（Ex/Em=545/570 nm）和 DAPI 激发/发射滤 片（Ex/Em=364/454 nm）。