T细胞有两种CAR，针对两种肿瘤特异性抗原（TAA），两种CAR带有不同的传导信号激发因子。只有两种CAR同时结合两种TAA，才能共激发对肿瘤杀伤效应的信号转导称为AND；一旦结合一种正常细胞表达的抗原就不激发称为NOT；结合一种TAA就激发称为OR。

最近的一篇来自于斯坦福大学的NATURE文章中[2]，作者使用ZAP-70（一种细胞内近端T细胞信号分子）取代传统的CD3ζ 结构域分子，可以激活T细胞并在体内根除肿瘤，同时可以绕过上游信号传导。ZAP-70的主要作用是磷酸化LAT和SLP-76，于是将LAT和SLP-76设计成基于AND的逻辑门控细胞内网络（LINK CAR）。但是从这篇文章来看，这种AND设计并不是一帆风顺的。

这篇文章评估CAR-T细胞杀伤作用的主要方法用到了大家耳熟能详的Incucyte® 实时活细胞分析系统，Incucyte® 也成为这篇NATURE的核心技术。

在设计AND逻辑门的CAR时，一个关键问题是如何避免出现自发二聚体，降低肿瘤杀伤的特异性作用。

首先，是对不同跨膜域的选择，考虑到如果用同样的跨膜结构域可能会产生二聚体，所以应尽量使用不同的跨膜结构域。基于此，作者首先研究了AA，BB，AB，BA四种跨膜域组合（A为CD28TM，B为CD8TM）。

图3：Incucyte® 实验显示,只有CD19-28TM-LAT+HER2-8TM-SLP-76（AB组合）显示出了一定的AND作用，但是仍然杀伤了CD19单阳。

为了进一步降低同源二聚或者异源二聚的可能性，突变了CD28TM上的一个半胱氨酸位点（2CA），但是仍然无法提高特异性。

LAT和SLP-76不会结合，为什么还是不行呢？作者进一步研究了这个信号通路发现，下游的一个适配分子 GADS，可能会同时和两个CAR结合，所以依然会形成二聚体。所以将两个CAR上的GADS结合位点的敲除后，特异性就提高了，真正获得了AND效果！

当然作者也尝试了其他抗原组合，比如CD19和ROR1，这种LINK CAR依然有效！

当然这种AND效果方法不只一个，比如SynNotch，但是相对于SynNotch，这篇文章的LINK显示出更佳的特异性。

这种CAR可以扩大CAR-T细胞靶向的分子范围，并将使CAR-T能够用于实体瘤和自身免疫等疾病和纤维化。此外，这项工作表明，细胞的内部信号机制可以重新利用为表面受体，其可能为细胞工程开辟新的途径。

为什么越来越多的高分文章都使用了Incucyte® ？