自动、定量、可视化？汇合度定量细胞增殖与毒性全攻略
时间：2024-12-04 阅读：72
细胞增殖是细胞数量随时间增加的生物学过程，是正常组织发育、再生和更新的重要机制。增殖的异常可能造成恶变和癌症病理。细胞毒性则指物质或环境变化对细胞健康的有害影响。细胞经毒性刺激处理后可能会损害代谢活性，抑制细胞生长，甚至通过复杂的生物学途径（如细胞坏死或细胞凋亡）导致细胞死亡。在细胞密集堆积或形态发生显著变化之前，细胞汇合度是评估细胞增殖和毒性的理想指标。
Incucyte® 实时活细胞分析系统能够在培养箱内进行长时程的实时自动化的检测，通过分析细胞图像面积随时间的变化（汇合度百分比），实现细胞增殖可视化和定量检测，并分析细胞毒性。
图1. 左上图为原始图片，左下图为圈描的细胞（黄色），右图为根据总细胞面积（confluency）绘制的生长曲线。
今天，陈老师将与大家分享几篇精彩的研究，展示如何使用Incucyte® 进行抗增殖作用和细胞毒性评估。
针对药物筛选的细胞增殖与毒性测试
威斯康星医学院[1]
N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种含硫醇基团的抗氧化剂，已被用作癌症生物学和肿瘤免疫学中的抗氧化药物。其作用归因于硫醇基团在线粒体中的抗氧化和氧化还原信号转导。然而NAC的生物利用率很低，需要高浓度才可以发挥功效。大量的体内外癌症研究发现，将三己基膦（TPP+）通过烷基侧链共轭到药物上，会使其选择性靶向癌细胞线粒体的作用显著增强。为了确定线粒体靶向硫醇对癌细胞增殖的影响，本文作者通过连接含有TPP+分子的烷基侧链，合成了线粒体靶向的Mito10-NAC及其甲基类似物（图2）。
图2. NAC，Mito10-NAC以及其甲基类似物结构图。
随后，作者使用Incucyte® 实时活细胞分析系统连续一周监测了以上6种硫醇分子对人胰腺癌（MiaPaCa-2）、人乳腺癌（MDAMB-231和MCF-7）、人非小细胞肺癌（A549）细胞系，以及作为对照的非恶性乳腺癌细胞系（MCF-10A）的细胞增殖影响。通过Incucyte® AI Confluence软件，对捕获的图像进行自动化的汇合度增殖定量分析。
结果显示，与非靶向母药相比，线粒体靶向NAC的抗增殖能力显著增强，且甲基化进一步提升了其抗增殖效果。NAC需要较高的浓度才能表现出一定的生物活性，但是会显著地影响正常细胞增殖。相较之下，Mito10-NAC则不仅低浓度就具备更好的生物活性，而且还不影响正常细胞的增殖生长。
图3. Incucyte® 软件的自动汇合度定量分析结果：NAC, Mito10-NAC以及其甲基类似物对MiaPaCa-2增殖作用的影响。所示数据为平均值± SD, n = 4 。Bar值小，重复性良好。真实反映了不同药物浓度下细胞汇合度随时间的变化；曲线旁边的高清细胞图像为对照细胞系的汇合度达到90%时（黑色竖线对应的时间点）对应的MiaPaCa-2细胞图像，黄色圈描展示了Incucyte® 对细胞外轮廓的准确识别，进而提供实时的汇合度定量分析。
Incucyte® 可自动计算IC50值[1]
基于Incucyte® 监测分析结果进一步计算不同细胞系的IC50值，结果显示，与非靶向母药相比，靶向线粒体的硫醇分子具有的癌细胞增殖抑制效力普遍增强100-500倍，Mito10-NAC高达1500-2400倍（图4）。也同时反映Mito10-NAC及其甲基类似物的抗细胞增殖作用可能与NAC清除活性氧或活性氮的抗氧化机制并无关联。
图4. 线粒体靶向药物和相应母体化合物对MiaPaCa-2的细胞增殖抑制作用比较。
用于最佳细胞接种密度筛选[2]
低级别浆液性癌 （LGSOC） 是一种罕见的上皮性卵巢癌。由于治疗选择有限，需要更有效的疗法来治疗复发性疾病。为了解决这个问题，在 12 种患者来源的 LGSOC 细胞系和 1 种正常卵巢细胞系中进行高通量药物筛选工作。为了建立细胞系生长动力学和最佳接种密度，将细胞系接种黑色384孔板中，并放置过夜。在 Incucyte®中以8小时的间隔拍摄相差图像（放大倍数10×），至少持续 168 小时，每 96 小时更换一次培养基。使用 Incucyte®评估细胞汇合度。选择扫描后 72 小时达到 70-80% 汇合度所需的最低接种密度进行高通量药物筛选。
图5. 以每孔 250–4500 个细胞/孔接种细胞，每个接种密度测试一式四份孔。Bar值小，重复性良好。
长时间活细胞检测以确定药物耐药性[3]
解旋酶WRN通过多次基因筛选被鉴定为具有微卫星不稳定性（MSI）癌细胞中的合成致死靶点。HRO761是一种有效的、选择性的、变构的WRN小分子抑制剂， 而伊立替康是一种用于晚期大肠癌治疗的拓扑异构酶抑制剂。研究表明，HRO761和伊立替康在低效浓度下的联合使用，能显著增强SW48细胞的抗增殖活性。在较高剂量的HRO761下，它能阻止体外细胞的长期再生（长达40天的跟踪）。体内实验也证实了HRO761和伊立替康联合用药的效果，使肿瘤完全消退。
图6. Incucyte® 生成的汇合图展示了长期暴露于指定浓度的HRO761和伊立替康（irinot.）组合的SW48细胞汇合情况，每7天换一次培养基；而在较高剂量的HRO761下，它阻止了体外细胞的长期再生。
使用Incucyte® 的关键优势
培养箱内可长达数周的连续观察，最短几分钟间隔拍摄，减少人力，防止过多操作对细胞的伤害
Incucyte® AI Confluence软件借助AI大数据驱动功能，对细胞边界进行准确识别，自动定量细胞汇合度随时间的变化，可以实现更直观、更可靠的细胞增殖监测分析
多个板位，分别独立设置检测程序，可以兼容各种孔板和培养皿，通量高
具有划痕、肿瘤球、类器官、趋化、血管生成等多个分析拍摄模块，并配套相应的耗材
高效简便的模块化软件设置和数据分析，输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数，使得结果更加准确
大于100种优化过的活细胞专用荧光试剂、耗材及详尽的Protocol
文章数>15,000篇，认可度广
Incucyte®长时程活细胞成像系统应用文集
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为了将Incucyte®推广到更多的活细胞实验，我们致力于提供全面的应用解决方案。《Incucyte®长时程活细胞成像系统应用文集》除了基础的细胞增殖和活性监测外（如细胞凋亡/周期/毒性等），还涵盖了抗体内化、旁观者效应、共培养杀伤、炎症反应（NETosis）、细胞吞噬、划痕实验、细胞趋化、类器官研究、肿瘤球分析、神经突生长、ATP 检测、线粒体膜电位、病毒/脂质体/外泌体监测、全孔成像等多个方面。应用范围广，是您寻找实验方法的有利工具。
-参考文献-
[1] Cheng, G., Hardy, M. & Kalyanaraman, B. Antiproliferative effects of mitochondria-targeted N-acetylcysteine and analogs in cancer cells. Sci Rep 13, 7254 (2023).
[2] High-throughput drug screening identifies novel therapeutics for Low Grade Serous Ovarian Carcinoma | Scientific Data (nature.com)
[3] Discovery of WRN inhibitor HRO761 with synthetic lethality in MSI cancers | Nature