人宫颈癌蛋白（hHCCR-1）ELISA 检测试剂盒

                                              Cat.No：PY-30001

1 试剂盒组分

注：2-8 ℃保存。

2需自备的试剂和耗材

3 检测原理

 该试剂盒基于夹心ELISA 检测原理，包含针对目的蛋白的捕获抗体和检测抗体，用于检测样品中的hHCCR-1。

1. 用1x 捕获抗体包被ELISA 板。
2. 用5% 的脱脂乳封闭。
3. 检测样品和标准品的孵育。
4. 用HRP 标记的IgY检测hHCCR-1。
5. TMB 显色。

1. 试剂的准备

  注：按以下步骤准备工作液。所有准备的试剂应充分混匀并在用前置于室温预热。

1）1X 稀释缓冲液：用前用双蒸水稀释10X 的缓冲液到1X。

2）1X捕获抗体IgY：用1X 稀释缓冲液稀释20X IgY捕获抗体。

3) ELISA 96孔板：

  选择需要的孔数，剩余的孔放入置干燥剂的密封袋中，袋需要重新密封，避免受潮。

1. 血液的收集和储存

1 ）  制备血清样品。

• 全血样品置于离心管中（不含抗凝剂），置于室温30min
• 4℃ 2000-3000g ，离心15 min。
• 用新鲜的血清样品或分装后-20℃保存备用。长期储存保存于-70℃。避免反复冻融。
  1. ）制备血浆样品。

用离心管收集全血样品到离心管（含终浓度1.735mg/ml K₃EDTA抗凝剂），收集后立即离心。

1. ）如果用肝素抗凝，肝素的用量对实验结果的影响，需提前测定。
2. ）避免使用溶血样品或脂血样品。

1. 样品的准备

用70ul 1x 稀释缓冲液稀释35ul血清样品。（推荐使用新鲜的血清样品）。

1. 标准品的准备

用前，等体积轻柔混合2X 稀释缓冲液和重组蛋白（1.024mg/ml）5分钟，避免出现气泡，直到蛋白溶解。混合液（0.512mg/ml）稳定性不超过1天。

标准品需用1x 稀释缓冲液，2倍系列稀释，起始浓度256 ng/ml 。每孔100ul。

1. 检测抗体（HRP标记）的稀释

用5% 脱脂乳1：500 稀释检测抗体，每孔100ul。

1. 底物稀释液

用前1:1 混合显色液A 和显色液B。每孔加入100ul，混合液稳定性不超过1天。

1. 操作程序

A 标准品、检测样品和对照的操作程序

1. 每孔加入100ul 1x IgY捕获抗体。轻轻封板，25℃孵育4小时。
2. 用400ul，1X PBST 洗板一次。
3. 每孔加入200ul 5% 脱脂乳。轻轻封板，25℃孵育1小时。
4. 用400ul，1X PBST 洗板一次。
5. 每孔加入检测的血清样品、标准品和阴性对照（1x 稀释缓冲液）100ul到对应孔中，做复孔。
6. 轻轻封板，4℃孵育Overnigt。

   B 检测抗体的应用

 1）用400ul，1X PBST 洗板一次。

 2) 每孔加入100ul 稀释后的（1：500）IgY 抗体。

 3）轻轻封板，25℃孵育1小时。

C 底物反应液

  1）用400ul 1X PBST 洗板3次。

  2）每孔加入100ul 底物混合液。

  3) 室温孵育5-20 分钟，每孔加入100ul 终止液。

  4）20min内读取450nm OD值。

  D  结果

  标准曲线用于确定检测未知样品中目的蛋白的含量。依据标准品的浓度(X轴)和对应的OD（Y轴），做标准曲线。

  1）计算每个标准品和样品的平均OD值。分析结果前，所有的OD需减去阴性对照（0ng/ml:空白孔）的OD 值。用OD做纵坐标，标准品做横坐标，做标准曲线。

    2）为了计算每个样品中目的蛋白的含量，需读取检测样品的OD值，找到对应的X轴样品浓度值，读取样品浓度。如果检测到的样品浓度，高于zui高样品浓度，重新稀释样品，重新做。zui后依据标准曲线读取的样品浓度 乘以稀释倍数，即为样品实际浓度。

    3）样品实际浓度为标准曲线读取的样品浓度 乘以样品稀释倍数，此试剂盒的样品稀释倍数为3。

   标准曲线示意图

 注：此说明书，仅供参考，以英文说明书为准