天狼猩红总胶原检测试剂盒

Sirius Red Total Collagen Detection Assay Kit（Catalog # 9062）

仅用于科研，不可用于诊断

背景简介：

天狼星红是一种*的染料，它与纤维性胶原（I型至V型）上的[Gly-X-Y]n螺旋结构特异性结合，不区分胶原蛋白种类和胶原类型，因此用于总胶原的检测。Chondrex提供天狼星红总胶原蛋白检测试剂盒，用于检测样本，包括：组织、细胞培养液和细胞中的总胶原蛋白。该试剂盒可检测40例样本（复孔），实验时间少于30min。由于细胞培养液总的胶原含量较低，可能需要对样本做浓缩处理。

产品说明：

产品描述：用于检测样本中的总胶原

形式：96孔可拆版

检测方法：比色法

实验时间：30min

检测范围：500 µg/ml to 8 µg/m

检测数量：40（复孔）样本/板

样本类型：组织匀浆、细胞培养液、细胞

样本稀释比：根据样本类型而定

发色团：N/A(510-550nm读取)

保存：-20℃ 保存12个月

试剂盒组成：

注：1）洗液，提取液，0.5M的醋酸和96孔板也可以室温保存

2）用于细胞培养液样本的的浓缩液（50 ml, Catalog # 90626)）不包括在盒子内，需要单独订购。

样本制备：

可用于检测组织匀浆样本和细胞。固体样本需要溶解后检测。此外，细胞培养液需要做浓缩处理（请参照第三页实验步骤）。另外，热变性的胶原对天狼猩红的结合性差，会导致结果值偏低。

依据溶解缓冲液的不同，以下胶原样本可用于检测：

1. 中性缓冲液溶解的胶原溶液（0.15mol/L NaCl in 0.1M Tris-HCl, pH 7.4）

2. 醋酸溶解的胶原溶液（0.05mol/L的醋酸）

3. 含胃蛋白酶的胶原溶液（0.05mol/L的醋酸，含胃蛋白酶）

Chondrex 推荐“制备含胃蛋白酶的可溶液胶原溶液”制备方案

细胞培养液样本制备：

含高浓度血清的细胞培养物会导致高背景值。因此，我们推荐用PBS降低细胞培养物中的血清浓度到5%。

样本浓缩：

细胞培养物中的血清浓度一般来说很低，因此用试剂盒直接检测细胞培养物中的胶原很难检测得到。Chondrex公司通过浓缩液（Cat # 90626)参照样本浓缩流程对样本进行浓缩。如果检测细胞培养物，请设置阴性对照，用浓缩液的话可能会导致背景升高。

1. 加入1ml细胞培养液

2. 加入250ul浓缩缓冲液

3. 涡旋混匀后，4℃孵育16-24小时

4. 10000rpm离心3min

5. 弃上清液

6. 加入100ul 0.05mol/L的醋酸溶解沉淀物。用溶解后的样本，作为检测样本。

7. 样本中胶原浓度为测定值x0.1。

操作流程：

1. 加入100ul稀释后的标准品和样本到管内。

2. 加入500ul天狼猩红溶液到管内

3. 混匀后，室温孵育20min,10000rmp离心3min,小心吸取上清，并弃上清。

4. 加入250ul提取液到各管内。

5. 涡旋混匀使沉淀物*溶解。

6. 从各管内取200ul到检测板

7. 读取530nm(510-550nm)吸光度

注意：

1. 推荐标准品和样本均做复孔检测

2. 所有的缓冲液在用前置于室温平衡。

3. 用移液管准确定量缓冲液体积，提供的缓冲液都是足量的。

4. 如果一次用不完的原液试剂，请还在原瓶内-20℃保存，用于后续实验。

5. 试剂盒含有未感染的动物的动物组分，丢弃请做生物安全处理。

实验流程：

1. 1X醋酸溶液制备：用双蒸水，制备足够的1X醋酸溶液（0.05M）。

2. 标准品制备：用1.5ml离心管或者细胞培养管制备标准品溶液，加入250ul 0.05mol/L的醋酸（空白）到7管内。加入250ul标准品（500ug/ml）和等体积的0.05mol/L的醋酸混合（250ug/ml）。一次重复此步骤，制备：125,63,31.5,16，和8ug/ml标准品溶液

1. 样本制备：用1.5ml离心管或者细胞培养管制备样本溶液。如果样本中的胶原浓度范围不确定，需要用0.05mol/L的醋酸溶液做系列稀释后，确定样本大概范围后再检测。

2. 加入样本和标准品：加入100ul ,空白，稀释后的标准品和样本到离心管内，做复管。

3. 加入天狼猩红溶液：加入500ul天狼猩红溶液到各管。涡旋混匀，室温孵育20min。

4. 离心：10000rpm离心3min。去除上清，不要接触底部的沉淀物。如果不小心接触到，重新离心，小心去除上清。

5. 加入洗液：加入500ul洗液到各管。涡旋混匀后，重悬沉淀物。

6. 离心：10000rpm离心3min。去除上清，不要接触底部的沉淀物。如果不小心接触到，重新离心，小心去除上清。

7. 加入提取液：加入250ul提取液到各管。涡旋混匀后，充分溶解。

8. 读数：从各管取200ul到96孔板。读取510-550nm的吸光度值。

结果计算：

1. 计算标准品，空白和检测样本的OD平均值。

2. 用标准品和样本OD平均值减去空白OD均值。

3. Y轴做OD值，X轴做标准品浓度，制作标准曲线。

4. 通过回归曲线计算样本浓度。样本实际浓度应在测值的基础上乘以相应的稀释倍数。

5. 如果OD值超出标准品检测范围，请对样本做稀释后，再检测。