JC-10 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit JC-10线粒体膜电位检测试剂盒

产品信息

JC-10线粒体膜电位检测试剂盒 荧光探针染色 JC-10线粒体膜电位检测试剂盒 荧光探针染色​   

产品描述

线粒体膜电位荧光探针JC-10是JC-1的升级产品，同样可用于检测线粒体膜电位的变化。因JC-1虽然在许多实验中被广泛应用，但是其水溶性很差，即使在1 μM浓度的条件下，JC-1也会在水的缓冲液中析出。而JC-10具有更好的水溶性，可以在某些需要高浓度染料的实验中替代JC-1。虽然在一些细胞系中JC-10有着比JC-1更好的表现，不过，JC-10的性能表现细胞依赖性特征。

正常细胞内，JC-10选择性聚集在线粒体基质中形成可逆的红色荧光聚合物（Ex=540 nm, Em=590 nm）；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-10由多聚体转变为单体形式存在于胞浆中，产生绿色荧光（Ex=490 nm, Em=525 nm）。JC-10不仅可用于定性检测，因颜色的变化可以非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。也可以用于定量检测，因线粒体的去极化程度可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。这两种颜色的变化可以用流式细胞仪上的标准滤光器检测到，绿色荧光可用FL1通道分析，红色荧光可用FL2通道分析。除了用于流式细胞术，也可以用于荧光成像和荧光酶标板检测平台。

本试剂盒中提供了阳性对照CCCP，其能诱导线粒体膜电位下降。对于六孔板中的样品，本试剂盒共可以检测100个样品。

 运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。-20℃干燥避光保存，分装，以避免反复冻融，一年有效。超纯水和JC-10染色缓冲液（5×）也可4℃保存。

使用方法

1. JC-10染色工作液的配置

 取适量JC-10（200×），按照每50 μL JC-10（200×）加入8 mL超纯水的比例稀释，剧烈震荡充分溶解并混匀JC-10，然后再加入2 mL JC-10染色缓冲液（5×），混匀后即为JC-10染色工作液。

2. 阳性对照的设置

取出试剂盒中供的CCCP（10 mM）按照1∶1000的比例加入到细胞培养液中，使其终浓度为10 μM，处理细胞20分钟。随后按照下述方法装载JC-10，进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常10 μM CCCP处理20分钟后线粒体的膜电位会*丧失，JC-10染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经JC-10染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料决定。

3. 细胞染色

3.1对于悬浮细胞

1）取1×105～6×105个细胞重悬于0.5 mL细胞培养液中（可以含血清和酚红），加入0.5 mL JC-10染色工作液，颠倒混匀。

2）37℃孵育20分钟。孵育期间，按每1 mL JC-10染色缓冲液（5×）加入4 mL蒸馏水的比例配制适量的JC-10染色缓冲液（1×），并置于冰浴，作为洗液。

3）37℃孵育结束后，600g  4℃离心3～4分钟，弃上清，注意尽量不要吸除细胞。加入1 mL JC-10染色缓冲液（1×）重悬细胞，600 g， 4℃离心3～4分钟，弃上清，重复一次。

4）用适量JC-10染色缓冲液（1×）重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。

3.2对于贴壁细胞

1）对于6孔板，吸除培养液，根据具体实验如有必要可用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1 mL细胞培养液（可

以含血清和酚红）。

2）然后加入1 mL JC-10染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。孵育期间，按每1 mL JC-10染色缓冲液（5×）加入4 mL蒸馏水的比例配制适量的JC-10染色缓冲液（1×），并放置于冰浴，作为洗液。

3）37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-10染色缓冲液（1×）洗涤2次。

4）加入2 mL细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

【注】：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。

3.3对于纯化的线粒体

1）把配制好的JC-10染色工作液用JC-10染色缓冲液（1×）稀释5倍。取5倍稀释的JC-10染色工作液0.9 mL 加入0.1 mL总蛋白量为10～100 μg纯化的线粒体。

2）用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描（time scan），激发波长为485 nm，发射波长为590 nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm时，可以在475～520nm范围内设置激发波长。

4. 荧光观测

检测JC-10单体时可以把激发光设置为490 nm，发射光设置为530 nm；检测JC-10聚合物时，可以把激发光设置为525 nm，发射光设置为590 nm。

【注】：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在zui大激发波长和zui大发射波长。如使用荧光显微镜观察，检测JC-10单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察GFP或FITC时的设置；检测JC-10聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如碘化丙啶或Cy3时的设置。

注意事项

1）JC-10（200×）在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20～25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

2）须把JC-10（200×）用试剂盒提供的超纯水充分溶解混匀后才可加入JC-10染色缓冲液（5×）。不可先配制JC-10染色缓冲液（1×）再加入JC-10（200×），否则JC-10将很难充分溶解并会严重影响后续的检测使用。

3）使JC-10染色缓冲液（1×）保持4℃左右，此时的洗涤效果较好。

4）JC-10探针装载完并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测过程。在检测前需冰浴保存。

5）请勿把JC-10染色缓冲液（5×）全部配制成JC-10染色缓冲液（1×），本试剂盒使用过程中需直接使用JC-10染色缓冲液（5×）。

6）如果发现JC-10染色缓冲液（5×）中有沉淀，必须全部溶解后才能使用，为促进溶解可以在37℃加热。

7）CCCP为线粒体电子传递链抑制剂，有毒，请注意小心防护。

8）为了您的an全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。