Fluo-8 AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针 

产品简介

Fluo-8（Fluo-2 Medium Affinity），是目前最亮的可见光激发波长Ca2+荧光探针，其荧光强度比Fluo-4强两倍，比Fluo-3强四倍。Fluo-8具中等程度的Ca2+亲和力，几乎接近Fluo-3，Fluo-4（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM），使用上几乎同Fluo-3和Fluo-4。Fluo-8不仅维持Fluo-3，Fluo-4便捷的光谱检测特性，与Ca2+结合后的最大激发波长为490nm，最大发射波长为514nm。而且具有改善的细胞载入和Ca2+响应能力。Fluo-8加载具较弱的温度依赖性，在室温或37℃孵育皆染色良好，不像Fluo-3，Fluo-4严格要求在37℃孵育，此特征使其更适用于HTS高通量筛选实验。Fluo-8应用广泛，与许多细胞系和靶向样本兼容，不会受配体或靶标本身信号干扰。

Fluo-8可通过激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光显微镜等来检测胞内钙离子水平的变化。Fluo-8, AM是Fluo-8的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Fluo-8，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。

本品以50ug小包装的冻干粉形式，用于细胞内Ca2+水平检测时，推荐浓度1-5uM。

Fluo-8 AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针 

基本特性

同义名：Fluo-8, AM

分子式：C50H50N2O23

分子量：1046.9316       

溶解性：溶于DMSO（1-5 mM）   

Ex/Em：490/514nm（Ca2+结合）；

储存条件：置于-20℃干燥保存，1年效期。

Fluo-8 AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针

使用方法

A 试剂准备

1）配制Pluronic F-127母液：称取100mg Pluronic F-127粉末（货号：Cat No. FS0432）中加入500ul DMSO,配制成20%(W/V)母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min.溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热溶解，不影响使用。

2）HHBS BUFFER(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer,pH7.3)或者其他生理缓冲液

B 操作步骤

1）用无水DMSO溶解Fluo-8,AM配制成1-5mM的储存液，或将已配好的Fluo-8,AM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50ugFluo-8,AM中加入11.9ul无水DMSO）。

2）用HHBS或其他生理缓冲液Fluo-8,AM+DMSO储存液稀释到1-10uM的工作液，提前加入适量的20%Pluronic F-127溶液，使其终浓度为0.02%。

【注（1）】：Fluo-8,AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4-5uM,具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得结果的基础上尽量使用zui低探针浓度。

【注（2）】：Fluo-8,AM工作液需现配使用，避免反复冻存。

【注（3）】：Pluronic F-127可以防止Fluo-8,AM在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低Fluo-8,AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存。

3）【可选】如果细胞内含有机阴离子转运体，丙磺su（Probenecid,1-2.5mM)或者，磺吡酮（Sulfinpyrazone,0.1-0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露。

【注（1）】：丙磺su或磺吡酮储存液相当偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH。

4）将准备好的Fluo-8,AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。37℃或者室温孵育20-60min。

【注（1）】：关于孵育的时间，如果首ci做实验不能确定，建议先孵育30min,看荧光效果；如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。

【注（2）】：降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。

5）吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如2.5mM丙磺酸的缓冲液）替换，去除多余探针。

6）用适当的仪器如激光共聚焦、流式细胞仪、荧光酶标仪等，用波长Ex/Em=490/520nm来进行检测。

【注（1）】：Fluo-8,AM进入胞内后，经酯酶降解形成Fluo-8，并不是以供价结合的形式滞留在细胞质内。因此不可对加载染料的活细胞进行固定处理，再进去Ca2+水平检测。

注意事项

1）荧光染料均匀在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）乙酰氧基甲酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后在开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3）Fluo-8,AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管底、或管壁或管盖内，可在20-25℃温育片刻至全部溶解后使用。

4）Fluo-8,AM第一次使用，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。

5）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。