怀菊花中活性物质的闪式提取与HPLC测定

王夏青 ¹，刘延泽²，卢付军²，郑秀明²，赵余庆^3*

（1.辽宁中医药大学，辽宁  沈阳  110032；2.河南金鼐科技发展有限公司，河南  郑州  450016；

3.沈阳药科大学，辽宁  沈阳  110016）

摘要  本文采用闪式技术对怀菊花活性物质绿原酸进行了提取工艺的比较（超声及药典法）和HPLC检测，优选了怀菊花的闪式提取工艺。

关键词  怀菊花；闪式提取；HPLC

菊花为常用传统中药，来源于菊科植物Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序。其味甘苦,性凉，具有散风清热，平肝明目之功效。主要用于风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花等症^[1]。菊花的有效成分为绿原酸和黄酮类，绿原酸已经被证明有抗菌和抗炎作用。2005年版中国药典采用HPLC法测定绿原酸的含量作为菊花质量的内控指标^[2]。

闪式提取技术是一种利用闪式提取器对于植物软、硬材料快速提取的新型提取技术。由于完成一次提取一般在1-3分钟左右，比传统方法更快速、简便，故被称之为闪式提取。其原理是依靠机械剪切力和超动分子渗滤技术，在室温及溶剂存在下数秒钟内将植物的根、茎、叶、花、果实等物料破碎至细微颗粒，并使有效成分迅速达到组织内外平衡，通过过滤达到提取的目的。闪式提取技术能够避免植物有效成分受热破坏，具有溶剂用量小，提取时间短，效率高等特点^[3]，是一种新兴的中药现代化提取关键技术。

本研究以菊花中绿原酸为检测指标，对怀菊花进行传统提取方法及闪式提取法的比较，并依据药典及文献方法对其中的绿原酸进行了HPLC测定，优选出怀菊花中绿原酸提取的*工艺。

1  实验部分

1.1 实验材料

     绿原酸对照品（中国药品生物制品鉴定所，编号：110753-200413）；怀菊花购于河南；甲醇为色谱纯；磷酸为色谱纯；磷酸二氢钠为色谱纯；水为双蒸水。

1.2 仪器

闪式提取器JHBE-50S（河南金鼐科技发展有限公司）；精密电子天平BS-124S(德国赛多利斯公司)；旋转蒸发仪RE-52A（上海亚荣盛华仪器厂）；恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；数控超声波清洗器KQ3200DB（昆山市超声仪器有限公司）；北京创维液相色谱仪（UV3000紫外检测器和色谱柱恒温箱）；CXTH-3000色谱工作站；色谱柱Kromasil C₁₈不锈钢柱(4.6×250mm)。

1.3 色谱条件及试样制备

1.3.1色谱条件

流动相为磷酸二氢钠缓冲溶液：甲醇（70：30）（取磷酸二氢钠15.6 g加水至1000 mL，制成0.1 mol·L^-1的溶液，加入磷酸适量，使pH值为2.7；流速为1.0 mL·min^-1；检测波长328 nm。

1.3.2标准溶液配制  

取绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，加水制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

样品溶液制备

1.3.3试样制备

基金项目：辽宁省天然药物现代分离与工业化制备工程技术研究中心（2006-19-10）

*通讯作者：： , : zyq4885

1.3.3.1回流提取法:

取本品粉末（过一号筛）精称1 g置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称重，回流2h，放冷，补充损失的甲醇量，摇匀，滤过，浓缩至近干，残渣用氯仿5 mL浸渍3分钟，弃去氯仿液，残渣挥去氯仿，加水适量使溶解，并转移至1 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。

1.3.3.2超声提取法

取干燥的样品适量1 g，精密加入甲醇50 mL，超声提取30 min，放冷,补充损失的甲醇量，摇匀，滤过，浓缩至近干，残渣用氯仿5 mL浸渍3分钟，弃去氯仿液，残渣挥去氯仿，加水适量使溶解，并转移至1 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。

1.3.3.3闪式提取法

考察三因素三水平，提取时间（A），A₁=1 min，A₂=2 min，A₃=3 min；提取次数（B），B₁=1次，B₂=2次，B₃=3次；液料比（C），C₁=30:1，C₂=50:1，C₃=70:1。

1.3.4线性关系考察 

精密吸取绿原酸对照品溶液0.1，0.2，0.4，1，2 μL，进行测定。以峰面积为横坐标，含量为纵坐标作图标准曲线如图1所示。其回归方程为：y = 40.023x + 1.6465，r=0.9998。结果表明，绿原酸在0.1 μg～2 μg范围内，进样量与峰面积之间线性关系良好。

1.3.5精密度试验 

精密吸取菊花闪提9号样品10μL 同时进样3次，测定含量，记录绿原酸峰面积，计算RSD％为2.24%，表明此标准曲线具有高的精密度。

1.3.6稳定性试验 

精密吸取闪提9号样品按0，2，4，6，8 h进样5次，记录峰面积，计算平均值，计算RSD％为2.62%，表明此方法在8 h内稳定性良好。

1.3.7重现性试验 

取样品4 g，按闪提法制备9号样品的方法，平行制备5份供试品溶液，测定含量，记录峰面积积分值，计算RSD％为1.52%，表明本方法重现性良好。

1.3.8加样回收率试验 

精密称定已知含量的菊花，加入一定量的绿原酸对照品，吸取一定量，按上述条件测定峰面积，按照标准曲线计算绿原酸对照品的量，RSD％为1.67%。

2  结果与讨论

2.1 结果

菊花闪提*工艺为料液比（30：1）提3分钟提3次 含量1.62%

表2-1菊花不同提取方法，提取物中绿原酸的含量（%）

2.2 讨论

利用闪式提取法提取怀菊花的有效成分，获得了较高提取率的绿原酸。其含量约为回流和超声提取法的2倍。可见闪式提取法显示出与药典记载方法和超声法相比较具有多方面的优势。

首先，闪式提取器提取法具有提取时间短的优点，仅需几分钟，便可以达到率的快速提取，节省时间和能源，这是其它提取法无法实现的。

其次，传统的提取方法一般需要长时间加热提取，不利于一些热敏性物质的稳定存在。而闪式提取器提取是在常温下进行的，对于药材中有效成分的破坏极小，更适合于热敏性物质的提取。

综上所述，闪式提取法是一种更为、节能、安全的全新的提取技术。

参考文献

[1] 周志祥，魏俊德. 液相色谱法测定菊花中绿原酸含量的方法改进. .时珍国医国药，2006，17(11)：:2221-2222

[2] 刘晓芳，马新玉，周钢. 中国药典菊花绿原酸含量测定方法的探讨. .新疆中医药，2006，,24(5)：78-79

[3] 刘延泽. 植物组织破碎提取法及闪式提取器的创制与实践. 中国天然药物，2007，5(6)：401-407.