细胞PTEN活性定磷比色法定量检测试剂盒产品说明书
时间:2017-10-30 阅读:189
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上海哈灵生物试剂检测中心 -
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189次细胞PTEN活性定磷比色法定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
细胞PTEN活性定磷比色法定量检测试剂是一种旨在使用特异性合成底物磷脂酰肌醇-3 ,4 ,5-三磷酸(PIP3),在PTEN去磷酸化后,释放出游离磷酸根,与孔雀绿染料发生显色反应后,采用比色法测定其峰值的变化,以此进行测算单位酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细胞裂解悬液样品的PTEN活性及其抑制剂的检测。广泛应用于细胞凋亡、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。
技术背景
细胞张力蛋白同源在10号染色体缺失性磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten;PTEN;EC3.1.3.67),又称为多发性晚期肿瘤突变基因1(mutated in multiple advanced cancers 1;MMAC1),是一个肿瘤抑制基因,位于染色体10q23.3,转录产物515kb,蛋白产物175氨基酸。PTEN蛋白含有一酪蛋白磷酸酶的功能区和约175个氨基酸左右的与骨架蛋白张力蛋白(tenasin)、辅助蛋白(auxilin)同源的区域,是一种双重特异性磷酸酶,能使酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酯酰肌醇(phosphoinositide)等去磷酸化。PTEN具有调节细胞周期、防止细胞过度生长和分开裂解、参与细胞凋亡、粘附、迁移、浸润,控制细胞内磷脂酰肌醇-3 ,4 ,5-三磷酸(Phosphatidylinositol-3,4,5- trisphosphate;PIP3)水平,调控Akt/PKB信号通路等功能。PTEN基因突变和缺失将导致肿瘤发生、发展和转移,以及多发性错构瘤综合征(Cowden syndrome)等。基于底物磷脂酰肌醇-3 ,4 ,5-三磷酸,在PTEN的催化下,水解产生磷脂酰肌醇-4 ,5-二磷酸(PIP2),同时释放出游离磷酸根,进而与孔雀绿染料发生显色反应产生其峰值的变化(660nm波长),以此测算PTEN的活性。
产品内容
清理液(Reagent A) 120毫升
裂解液(Reagent B) 10毫升
缓冲液(Reagent C) 1毫升
阴性液(Reagent D) 1毫升
反应液(Reagent E) 200微升
终止液(Reagent F) 1毫升
显色液(Reagent G) 4毫升
标准液(Reagent H) 500微升
产品说明书 1份
保存方式
保存裂解液(Reagent B)、缓冲液(Reagent C)、反应液(Reagent E)和显色液(Reagent G)在-20℃冰箱里,避免反复冻融;其余的保存在4℃冰箱里;终止液(Reagent F)和显色液(Reagent G)具有腐蚀性,避免直接用手接触;显色液(Reagent G)避免光照,有效保证6月
用户自备
15毫升离心管:用于样品处理的容器
1.5毫升离心管:用于样品处理和保存的容器
细胞刮脱棒:用于贴壁细胞脱离
(微型)台式离心机:用于样品收集
培养箱:用于孵育反应物
比色皿:用于比色的容器
分光光度仪:用于比色分析
实验步骤
实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液放进冰槽里融化。然后进行下列操作。
二、测定准备
管号 | 阴性液(Reagent D) | 标准液(Reagent H) | 测定体系标准磷浓度 |
1 | 0 | 100微升 | 20微摩尔/升 |
2 | 25微升 | 75微升 | 15微摩尔/升 |
3 | 50微升 | 50微升 | 10微摩尔/升 |
4 | 75微升 | 25微升 | 5微摩尔/升 |
5 | 100微升 | 0 | 0 |
{[根据标准曲线获得样品活性对应磷浓度(微摩尔/升)—根据标准曲线获得样品背景对应磷浓度(微摩尔/升)]X 5(体系倍数)X样品稀释倍数}÷ 10(反应时间;分钟)=纳摩尔磷/毫升/分钟÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=纳摩尔磷/毫克/分钟
注意事项
质量标准