siRNA干扰载体构建与引物设计

siRNA干扰载体构建过程中，针对siRNA设计的引物是怎么设计的?

一般是合成一对引物，然后退火，再与线性化的载体做连接。由于引物比较长，所以合成时一般都会有比较多的碱基突变，因此，做shRNA表达载体构建的主要难度，在于筛选出正确的克隆，有时候可能要选很多个克隆测序才能筛到想要的。具体的序列组成，一般是sense-loop-antisense。不同的公司会有不同的设计原则的。

经验：我们一般不去考虑构建载体来得到siRNA！
载体表达siRNA方法主要存在以下缺点：
1、外源导入shRNA的表达会干扰细胞本身miRNA的正常表达，而miRNA在基因的表达调控方面有着至关重要的作用，目前已经证实很多疾病的产生通miRNA的表达异常存在确切关系，已有很多文献报道和证实；
2、载体构建的周期长，操作较为复杂，试验重复性不好，做过的人应该大多都知道；
3、载体用于体内试验的毒性非常大，容易激发机体强烈的免疫应答反应，副作用大，已有多篇文献证实；
4、通量低，影响因素更多，体内试验的效果很差，存在安全性的问题；
5、shRNA的表达在时间和表达量上都较难控制等。
这也是为什么现在10多种进入临床试验的RNAi药物几乎都是用化学合成的siRNA来做的原因！