XSELECT HSS XP色谱柱入门指南（含连接安装及平衡）

  每根XSelect HSS XP 2.5μm色谱柱都随附COA报告和性能测试色谱图，保存于eCord智能芯片或柱盒内。COA报告为XSelect HSS XP 2.5μm色谱柱中所用的填料批次所特有，包括填料批号、未键合填料和键合填料分析结果，以及色谱结果和检测条件。性能测试色谱图提供每根色谱柱的以下信息：填料批号、色谱柱序列号、USP理论塔板数、USP拖尾因子、保留因子以及色谱测试条件。这些数据应妥善记录和保存，以备将来参考或通过ACQUITY UPLC控制台访问。

a．色谱柱连接

  XP 2.5μm色谱柱专为在任意HPLC、UHPLC或UPLC系统上运行而设计。鉴于缺乏行业标准，所以请注意，不同系统的接头和连接件类型会因制造商不同而有所差异，安装时应采用与具体色谱柱相匹配的接头和连接件。

  如果色谱柱末端接头的类型与压力螺母/锥箍管路深度设置匹配不佳，色谱性能会受到负面影响，或者可能发生渗漏。

b. 色谱柱安装

注：下述步骤给出的流速适用于2.1 mm内径色谱柱。请根据第VI节（其它信息）中给出的流速和压力指南调整流速。

1. 灌注泵系统，排出含缓冲液的流动相，然后连接色谱柱的入口。

2. 用100%有机流动相（甲醇或乙腈）冲洗色谱柱，泵流速设置为0.1 mL/min，并在5 min内增加至0.5 mL/min。

3. 当流动相可从色谱柱出口自由流出且无气泡时，停止液流并将色谱柱出口连接至检测器。这能防止空气进入检测系统，使系统更快达到基线平衡。

4. 按照步骤2所述逐渐增加流速。

5. 监控仪器状态，直到柱压和基线达到稳定。

c. 尽可能减小谱带展宽体积

  谱带展宽是系统扩散性的量度，而系统扩散性可影响色谱性能。内部管路直径和管线连接可显著影响系统谱带展宽和色谱性能。管路内径增大会导致峰过宽和灵敏度降低（图1）。

d. 测量谱带展宽体积

注：该测试应在配备UV检测器的LC系统上进行。

1. 断开色谱柱与系统的连接，将色谱柱替换为零死体积二通。

2. 将流速设置为1 mL/min。

3. 制备测试混合物（溶于流动相），使其峰高在0.5 AU-1.0 AU范围内（可使用系统启动测试混合物，P/N：WAT034544）。

4. 进样此溶液2-5μL。

5. 采用5-Sigma法测量4.4%峰高处的峰宽：

谱带展宽(μL) = 峰宽(min) x 流速(μL/min)

（比如，如果峰宽 = 0.1 min，流速 = 1000μL/min，则谱带展宽 = 100μL）

e. 测量系统延迟体积

  测量延迟体积比测量系统谱带展宽更困难。系统延迟体积是初始梯度条件到达色谱柱柱头所需体积的量度。在不同LC系统之间转换方法时，计算系统延迟体积尤其有用。

1. 断开色谱柱与系统的连接，将色谱柱替换为零死体积二通。

2. 使用乙腈作为流动相A，使用0.05 mg/mL的尿嘧啶乙腈溶液作为流动相B。

3. 监测254 nm处的UV吸光度。

4. 在目标仪器上运行初始方法的流速和预期流速。

5. 采集运行100%流动相A时的基线5 min。

6. 在5 min处，设置流动相B为100%，然后继续采集数据5 min。

7. 测量100%流动相A和100%流动相B之间的吸光度差值。

8. 测定该吸光度差值的50%处的时间。

9. 计算梯度起点与50%点之间的时间差值。

10. 将时间差值乘以流速，计算出系统体积。

f. 色谱柱平衡

XSelect HSS XP 2.5μm色谱柱出厂时保存于100%乙腈中。在更换为其它流动相体系之前，务必确保流动相的兼容性。请用至少10倍柱体积的流动相平衡色谱柱（色谱柱体积请参阅表3）。当柱压稳定后，可认为色谱柱已达到平衡。

  为了避免流动相缓冲液在色谱柱或系统中发生沉淀，请使用5倍柱体积的水/有机溶剂冲洗色谱柱，其中有机溶剂比例应与所需缓冲流动相中的有机溶剂比例相同或更低（例如，引

入60%甲醇/40%缓冲液流动相之前，应使用60%甲醇水溶液冲洗色谱柱和系统）。

注：如果流动相中的添加剂（如离子对试剂）浓度较低(< 0.2%v/v)，那么完成平衡可能需要100-200倍柱体积的流动相。此外，当流动相中含有甲酸盐（如甲酸铵、甲酸等）时，平衡时间可能会延长。

g. 正相应用的溶剂转换

  XSelect HSS Cyano XP 2.5μm色谱柱既可用于反相分离，也可用于正相分离。色谱柱出厂时保存于100%乙腈中，可直接用于反相条件。

  如果要将XSelect HSS Cyano色谱柱用于正相应用，则必须遵循以下溶剂转换步骤：

1. 用至少20倍柱体积的100%甲醇冲洗色谱柱，采用低流速以免LC系统超压。色谱柱体积信息请参阅表3。

2. 用至少20倍柱体积的100%异丙醇冲洗色谱柱，采用低流速以免LC系统超压。色谱柱体积信息请参阅表3。

3. 用至少20倍柱体积的100%二氯甲烷冲洗色谱柱，采用低流速以免LC系统超压。色谱柱体积信息请参阅表3。

4. 采用预定的流动相条件冲洗色谱柱，直至基线稳定。

h. eCord安装

  如果色谱柱是安装在ACQUITY UPLC系统上，在追踪和管理色谱柱使用情况时，eCord技术具有显著优势。将黄色芯片座与ACQUITY UPLC柱温箱模块右侧的读/写装置相连接，即可

读取eCord。

  诸如色谱柱制造QC数据和COA报告等内置信息随后可通过ACQUITY UPLC控制台访问。

i. 初始柱效测定

1. 使用色谱柱之前，需要先执行柱效测试，以追踪色谱柱性能随时间的变化情况。这项测试可包括：

a. 您所在实验室常用的分析测试混合物

b. “性能测试色谱图”（可通过eCord访问）中的分析混合物。

注：如果采用(b)项的分析物进行柱效测试，那么您所在实验室在等度条件下测得的柱效可能低于沃特世“性能测试色谱图”中所示的柱效。

  这是正常并且符合预期的。沃特世对等度色谱柱测试系统进行了改造，尽可能减小了系统扩散。目的是更严格地测试色谱柱填充质量，同时保证填充柱品质。这些经过改造的特殊测试系统不再具有商业可行性，方法的灵活性亦受限，只能用于等度色谱柱测试。

2. 测定理论塔板数(N)，并定期对比该数值。

3. 定期进行重复测试，以追踪色谱柱性能随时间的变化情况。使用不同的LC系统进行测试，所得柱效结果可能会有微小差异，这可能是由于连接质量、运行环境、系统电子设备、试剂质量、色谱柱条件和操作员技术等因素所致。

j. VanGuard保护柱

  VanGuard™保护柱是2.1 mm（内径）x 5 mm（长）保护柱，可在保护分析柱的同时，尽可能降低使用保护柱带来的负面扩散影响。VanGuard保护柱填充的固定相与XP 2.5μm系列

色谱柱相同。VanGuard保护柱可直接连接eXtended Performance [XP] 2.5μm色谱柱入口。

注：VanGuard保护柱出厂时配有箍环和锥箍，但并未固定。因此用户可根据具体的XP 2.5μm色谱柱选用匹配的VanGuard保护柱，确保连接无空隙且无渗漏。

  取下将这两个部件固定至保护柱管路的O形圈时，必须谨慎操作。

VanGuard保护柱安装说明

1. 将VanGuard保护柱从外盒和包装套管中取出，取下塑料塞。

2. 固定保护柱，使外接头朝上，小心地取出在运输期间用于固定箍环和锥箍的黑色O形圈（箍环和锥箍未进行永久性连接）。

3. 将XP 2.5μm色谱柱入口朝下，垂直于工作台表面。

4. 从下方将VanGuard保护柱推入色谱柱入口，然后将色谱柱和保护柱翻转180°，使保护柱位于上方。

5. 如图4所示，将两个5/16英寸扳手分别置于XP色谱柱的平坦部分和VanGuard保护柱六角螺母（外接头）处，然后拧紧。

6. 将VanGuard保护柱压在XP 2.5μm色谱柱上，同时拧紧以固定箍环和锥箍。

7. 松开接口并检查锥箍深度，确保锥箍完全固定。

8. 将保护柱低流速纯有机相活化后再重新连接至XP 2.5μm色谱柱前端，设置流速并检查是否渗漏。