KRAS热度已经消退了？NO...据调查，现在除传统针对KRAS靶点小分子药物外，更多玩家尝试新兴疗法征服这一“不可成药”的难题，如疫苗，TCR-T疗法等。KRAS可以被细胞外信号以及来自细胞器等亚细胞结构的信号所激活。在正常的生理环境下，野生型KRAS主要处于不活跃的GDP结合状态。信号促使KRAS脱离GDP，并与GTP结合，将KRAS转化为激活状态。激活的KRAS能够结合并激活效应蛋白，如RAF激酶、PI3K和RalGDS，促进下游级联的信号通路，如MAPK、PI3K和Ral-GEFs通路。这些信号通路通过细胞复制、生长、分化和促进细胞周期进程。一个激活的致癌KRAS基因导致一个突变的KRAS蛋白，由于GTP水解率大大降低，异常长时间保持其活性GTP结合状态。当KRAS蛋白被困在“ON”位置时，下游效应通路也保持活跃，细胞增殖率保持很高。其他仍然活跃的效应通路包括那些促进肿瘤发展过程的通路，如有丝分裂、细胞迁移、肿瘤侵袭和血管生成。 一、高通量筛选试剂盒HTRF®技术提供均相，免洗KRAS结合检测试剂盒，通过这些已验证的试剂盒，可直接用于抑制剂筛选，无需优化，每个试剂盒配有重组蛋白、检测试剂和缓冲液。如下图所示，使用抗Tag1-SOS1（供体）和抗Tag2-XL665（受体）检测Tag1-SOS1与Tag2-KRAS-G12C之间的相互作用。当供体和受体抗体由于SOS1和KRAS-G12C结合而接近时，供体抗体的激发触发向受体抗体的荧光共振能量转移（FRET），受体抗体在665nm处特异性发射。这种特异性信号与KRAS-G12C/SOS1相互作用的程度成正比。因此，化合物或抗体阻断KRAS-G12C/SOS1的相互作用会导致HTRF®信号的减少。  
 使用已知抑制剂对试剂盒进行验证，均获得相应较好的IC50并且与已报道文献结果相一致。 
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 二、KRAS靶点相关蛋白全部KRAS相关蛋白均已原核表达系统（E.coli）进行表达。通过HTRF方式验证其结合活性。 1、KRAS WTThe KRAS-WT activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS- WT protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.

2.KRAS-G12CThe KRAS-G12C activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G12C protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal. 3.KRAS-G12D The KRAS-G12D activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G12D protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal
4.KRAS-G12RThe KRAS-G12R activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G12R protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.

5.KRAS-G12VThe KRAS- G12V activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS- G12V protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.
6.KRAS-G13CThe KRAS-G13C activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G13C protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.
7.KRAS Q61HThe KRAS-Q61H activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-Q61H protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.

8.SOS1 

9.RAF
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*以上KRAS蛋白无GTP bound，如需GTP bound，可联系优宁维。上述蛋白，常规规格有：50μg，100μg和1mg，如需更大规格，可联系优宁维定制。 三、Anti-Tag抗体话说，不想用试剂盒的情况下，如何建立assay呢？蛋白已经有了，还差检测抗体...这不就来了！Anti-Tag的HTRF荧光抗体，在实现高通量，操作简便等其他技术优势的同时，可以为assay的建立提供最大的灵活性。无关乎蛋白本身，仅针对标签如His，GST，FLAG等，选择对应的配对抗体即可实现实验方法学开发。比如：参考上述蛋白KRAS G12C（his Tag）和SOS1（GST tag），选择抗体配对有几种方式可供参考：

 下图为Anti-GST-Tb SOS1与Anti-his-XL665 KRAS G12C搭配组合展示。 
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 三、下游磷酸化蛋白检测Alpha®和HTRF®技术基于细胞水平进行下游KRAS信号通路的研究，包括MAPK、PI3K和Ral-GEFs通路。这些细胞信号分析能够区分化合物调节下游KRAS通路的功效。HTRF®仍然利用夹心法原理，标记的特异性抗体识别磷酸化蛋白和总蛋白从而进行定量检测。全过程无需洗涤，特异性好，灵敏度高。 

下图为p-ERK（图左）和p-NFkB（图右）磷酸化试剂盒灵敏度与WB对比，灵敏度高出30倍不等。

与HTRF®技术不同，Alpha®虽然也是均相检测检测技术，但其基于化学发光原理，利用两个微珠进行检测来实现更低的实验背景和超高灵敏度。一个抗体被生物素化并与链霉亲和素包被的供体微珠结合，受体微珠则直接与另一个抗体结合。抗体与磷酸化蛋白（总蛋白）结合使供体和受体微珠靠近。供体微珠的激发使得单线态氧扩散至受体微珠，从而发射615nm波长的光信号。Alpha®的检测信号与样本中存在的磷酸化蛋白（总蛋白）的数量成正比。Alpha®原理如下图。 

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 四、3D细胞增殖


基于ATP的发光法测定细胞增殖和细胞毒性的分析原理。用适当缓冲液直接裂解细胞后，对细胞ATP进行定量。在裂解细胞释放的ATP作用下，ATP与添加的荧光素反应产生光。

ATPlite 3D and ATPlite 1step 3D Assay 操作流程如下：

ATPlite 3D检测可以允许细胞密度较高情况下进行检测，并且比2D检测效果明显。
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四、微孔板耗材1.3D细胞培养板①板底为高度生物相容的，超低吸附力聚合物包被du有的合成聚合物MPC，源于细胞膜组分，与极性基团的磷脂（磷脂酰胆碱）具有相同的结构，提供自然生长环境，并消除批间差异。②易形成形态大小均匀的球体细胞球体高质量形成率，细胞形态均已一致，板材的均匀性高，可随时聚焦进行图片拍摄，提供重复性更高的数据及更高效更高质量的成像。③无需更换培养基实验的佳选择圆底板，性价比高。
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