产品名称：His标签纯化树脂(Ni-NTA Resin)NiSepharose 6FF镍-琼脂糖凝胶 6FF
产品编号：P2010
规格：5ml/ 10ml（凝胶体积） 
保存：4°C保存，有效期至少一年 
产品说明： 
 Ni-NTA琼脂糖凝胶 6FF是用于纯化 6×His标签重组蛋白的一种纯化介质，它是由 6%交联的Sepharose耦连了一种四齿螯合剂NTA而得.  His标签纯化树脂可用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的6×His标签重组蛋白。NTA，含有四个螯合区，较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+。6×His可与Ni2+螯合，从而使His标签蛋白结合在Ni-NTA纯化介质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低pH缓冲液的温和洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白。His标签纯化树脂与His标签蛋白具有的亲和力，可达 5-20 mg/ml。
可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的His标签纯化树脂。纯化程序简单，所得的蛋白纯度可高达 95％。Ni-NTA His标签纯化树脂可再生 4-6 次，重复使用。His标签纯化树脂悬浮液为 20％乙醇，已螯合Ni2+。 
操作方法： 
 A.  非变性条件下抽提 His 标签蛋白 
 1)  准备细胞，接种，诱导表达。收集细胞，置于-70°C 或立即进行步骤2操作。 
 2)  加入1/20细胞生长体积的 NTA-0 Buffer和 PMSF。PMSF 使用的工作浓度为 1 mM 现用现加。 
 3)  将细胞悬浮起来，加入溶菌酶，混匀，冰上放置 30 分钟，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。 
 4)  加入10% Triton X-100, 使终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置 15 分钟。 
 5) 12000 rpm/min(20,000×g 以上)，4°C 离心 15 分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20°C 保存。 
 6)  将 His标签纯化树脂装入合适的层析柱，层析用 10倍 NTA体积的 NTA-0 Buffer洗。 
 7)  将样品加至 NTA层析柱中，流速在 15 ml/h 左右，收集穿透部分，用 SDS/PAGE 分析蛋白的结合情况。
 8)  层析用5倍 NTA体积的 NTA-0 Buffer洗，流速控制在 30 ml/h 左右。 
 9)  分别用5倍 NTA体积的 NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000 Buffe洗脱，流速控制在 15 ml/h 左右，收集洗脱液，每管收集一个 NTA体积。 
 10)  确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。为有效的方式是 SDS-PAGE 分析。也可以用 Bradford  蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白质的分布。 
 11)纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。 
 NTA-0  、 20、 40、 60、 80、 100、 200、 1000Buffer分别为浓度 20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol，添加 0、20、40、60、80、100、200、1000 mM Imidazole。  
 B.变性条件下从包涵体中纯化 His标签蛋白 
 1)  准备细胞，接种，诱导表达。收集细胞，置于-70°C 或立即进行步骤2操作。 
 2)  加入1/20细胞生长体积的 GuNTA-0 Buffer和 PMSF。PMSF 使用的工作浓度为1mM现用现加。 
 3)  将细胞悬浮起来，冰上超声破碎细胞，降低粘稠度。 
 4)  室温放置30 分钟，间或混匀或用磁力搅拌。 
 5) 12000 转/分（20,000×g 以上），4°C 离心 15 分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20°C 保存。
 6)  将 NTA树脂装入合适的层析柱，层析用 10倍 NTA体积的 GuNTA-0 Buffer洗。 
 7)  将样品加到 NTA 层析柱中，流速控制在 15 ml/h 左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白质的结合情况。 
 8)  层析用5倍 NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在 30 ml/h 左右。 
 9)  分别用 5 倍 NTA 体积GuNTA-20、GuNTA-40，GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500 洗脱，流速在15 ml/ h 左右，收集洗脱液，每管收集一个 NTA体积。 
 10)  确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。为有效的方式是 SDS/PAGE 分析。也可以用 Bradford  蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白质的分布。 
 11)  目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。 
 12)  纯化的目标蛋白质需要复性，复性常用的手段可以参考有关手册确定的原则。 
 GuNTA-0  、20、40、60、100、500Buffer 分别为浓度 20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,6 M 
Guanidium HCl 添加0、20、40、60、100、500 mM Imidazole。 
 C. NTA树脂的再生 
 NTA 树脂在使用若干次数（3-5 次）后，结合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高树脂的使用寿命和蛋白质的结合效率。NTA 树脂再生前需要从层析柱下端流干所有溶液，估计出 NTA 的树脂体积，按下列次序将再生试剂加到层析柱里，在等上一步再生溶液流干后，再加下一步再生溶解。用户需要自行准备25%、 50%、75%、*（v/v）乙醇和去离子水。 
  从层析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA树脂体积的 Stripping Solution I、2 倍体积的去离子水、3倍体积的 Stripping Solution II、1倍体积的 25%乙醇、1 倍体积的 50%乙醇、1 倍体积的 75%乙醇、5 倍体积的 *乙醇、 1 倍体积的 75%乙醇、 1 倍体积的50%乙醇、 1 倍体积的 25%乙醇、 1 倍体积的去离子水、 5 倍体积的Strippin Solution III、3 倍体积的去离子水分别洗一遍。 
  如果立即使用，用5倍体积的Ni Charging Solution洗，再用10倍体积的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-Buffer）洗；如果想*储存，加入 1 倍体积的20%乙醇，4°C 保存，使用前用 5 倍体积的 Ni Charging Solutio洗，再用 10倍体积的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗 
  再生溶液配方：Stripping Solution I:  6M GuHCl, 0.2M acetic acid。Stripping Solution II: 2% SDS。Stripping Solution III: 100 mM EDTA, pH 8.0。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4 
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