Mouse IL-6 ELISA KIT目       录

背景介绍………………………………………………………………………………

检测原理………………………………………………………………………………

注意事项………………………………………………………………………………

安全提示………………………………………………………………………………

试剂盒组成及储存……………………………………………………………………

自备实验器材…………………………………………………………………………

样品收集及储存………………………………………………………………………

试剂准备………………………………………………………………………………

检测步骤………………………………………………………………………………

结果判断………………………………………………………………………………

参数表征………………………………………………………………………………

参考文献………………………………………………………………………………

常见问题分析及解决办法……………………………………………………………

Mouse IL-6 ELISA KIT背景介绍：

白细胞介素-6（IL-6）是由纤维母细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、角质细胞、以及多种瘤细胞所产生。IL-1、TNF-a, PDGF、病毒感染、双链RNA及c AMP等，均可诱导正常细胞产生白介素6。白介素6能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。IL-6由2条糖蛋白链组成；1条为α链，分子量80KD；另1条为β链，分子量130KD。α链缺少胞内区，只能以低亲合性与IL-6结合，所形成的复合物迅即与高亲和性的β链结合，通过β链向细胞内传递信息。IL-6主要有以下生物特性：诱导B细胞分化；支持浆细胞瘤和骨髓瘤增生；诱导IL-2和IL-2受体表达；诱导单核细胞分化；诱导CTL；增强NK细胞活性；诱导急性期反应分子并刺激肝细胞；诱导神经元分化；诱导肾小球膜细胞生长；诱导角质化细胞生长。

检测原理：

    Solarbio (Solarbio ®)ELISA试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将抗小鼠IL-6单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的小鼠IL-6会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入生物素化抗小鼠IL-6抗体，该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的小鼠IL-6发生特异性结合；洗板后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，生物素与链霉亲和素会发生高强度的非共价结合；洗板后加入显色剂底物TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的小鼠IL-6，则HRP会使无色TMB变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的小鼠IL-6浓度与OD成正比，通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中小鼠IL-6的浓度。

注意事项：※※※

1. 试剂盒应在有效期内使用，请不要使用过期的试剂。

2. 试剂盒未使用时应保存在2-8℃冰箱，已复溶但未用完的标准品，请丢弃。

3. 试剂盒使用前请在室温恢复30 min，且充分混匀试剂盒里的各种成份及制备的样品。

4. 在试验中标准品和样本建议作复孔检测，且加入试剂的顺序应保持*。

5. 为避免交叉污染，请在试验中使用1次性试管，枪头，封板膜（※）及洁净塑料容器。.

6. 浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物的体积较少，在运输过程中微量液体会沾到管壁及瓶 

盖上，使用前请离心处理（5-10 S即可），使管壁上的液体集中在管底部，取用时，请用移液器小心吹打几次。

7. 除了试剂盒中的浓缩洗涤液和终止液可以通用外，请不要使用其他来源试剂盒内含的 试剂代替本试剂盒中的某单个组分。

8. 为保证结果准确，每次检测均需做标准曲线。

安全提示：试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作人员在使用时请带上手套并注意防护；在操作过程中也要避免试剂接触皮肤和眼睛，如果不慎接触，请用大量清水清洗；检测血液样本及其它体液样本时，请按国家生物实验室安全防护有关管理规定执行。

试剂盒组成及储存：

自备实验器材（不提供，可代购）

1． 酶标仪（主波长450nm，参考波长630nm）

2． 高精度移液器及一次性吸头：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板机或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 双蒸水，去离子水，量筒等

6． 稀释用聚丙烯试管

样本收集及储存：

1. 细胞培养上清：

将细胞培养基移无菌离心管，在4℃条件下1000×g离心10 min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），避免反复冻融。

2. 血清样本：

室温血液自然凝固20 min后，在4℃条件下1000×g离心10 min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），保存过程中如有沉淀，请再次离心，避免反复冻融。

3. 血浆样本：

将全血收集到含抗血凝剂的管中，根据标本的实际要求选择EDTA，柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合20 min，在4℃条件下1000×g离心10 min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），避免反复冻融。

※注意：血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本，以免影响检测结果；如果样本中的靶标物检测浓度高于标准品的高值，请将样品做适当倍数稀释后检测，建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。

试剂准备：

1. 试剂回温：先在实验前30 min将试剂盒，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，请放入37℃温浴直到结晶全部溶解。

2. 配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用双蒸水或去离子水将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍应用液，未用完的浓缩洗涤液放入4℃冰箱保存。

3. 标准品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液（SR1）1ml冻干标准品中，静置15分钟待其*溶解后轻轻混匀(浓度为1000pg/ml)，用移液器吸出溶解好的标准品原液250ul,加入750ul标准品/样本稀释液（SR1）(浓度为250pg/ml)，然后按照以下浓度：250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9、 0 pg/ml进行稀释。复溶过的标准品原液（1000pg/ml）未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装，并将其贮存在-20～-80℃冰箱，具体如下图。

4. 生物素化抗体工作液：预先计算好试验所需用量，用检测稀释液（SR2）将100倍抗体浓缩液稀释成1倍应用工作液（稀释前充分混匀），请在30分钟内加入到反应孔中。

生物素化抗体工作液具体稀释方法如下：

5. 酶结合物工作液：按每次试验所需用量配制，用酶结合物稀释液（SR3）将100倍浓缩酶结合物稀释成1倍应用工作液（稀释前离心），请在30分钟内使用。

酶结合物工作液具体稀释方法如下：

6. 洗涤方法：

l 自动洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，注入洗涤液为300ul/孔,注与吸出间隔为30秒，洗板5次。

l 手工洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，用洗瓶加入洗涤液300ul/孔，静止30秒后甩净酶标板孔中液体，在厚迭的吸水纸上拍干，洗板5次。

结果判断：

1.用酶标仪 450 nm 波长测定 OD 值。选择双波长检测，参考波长为 630 nm。如不能进行双波长检测，请用 450 nm 的OD测定值减去630 nm的OD测定值。

2.计算标准品、样品的平均OD值：每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值

3.以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用软件绘制标准曲线，样品中IL-6含量可通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。

参数表征：

1. 数据及标准曲线

本图仅供参考，应以当次试验标准品绘制的标准曲线计算小鼠IL-6的样本含量

2. 灵敏度：

低可检测小鼠IL-6浓度达2pg/ml，

20个零标准品浓度OD的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度。

3. 特异性：

不与小鼠CT-1、 gp130、 IL-11、 LIF反应，人的IL-6、IL-6 sR 等反应

4. 重复性：

板内，板间变异系数<10%

5. 回收率：

在选取的健康小鼠血浆、细胞培养上清中加入 3 个不同浓度水平的小鼠 IL-6，计算回收率。

6. 线性稀释：

分别在选取的4 份健康小鼠血浆和细胞培养上清中加入高浓度小鼠 IL-6，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。