研究人员改进从酵母中提取gDNA的方法
时间:2012-09-24 阅读:1648
研究人员改进从酵母中提取gDNA的方法
背景:
细胞壁是快速裂解酵母细胞的主要障碍。从酵母细胞中制备gDNA的传统方法包括使用破壁酶和玻璃珠,之后通过去垢剂裂解细胞,并利用酚-氯仿提取gDNA。在分析大量样品时,这些方法相当耗时,也相对较贵。
在快速分析时,也可以通过反复冻融裂解细胞。尽管这种方法相对较快,但是在氯仿抽提之后需要将样品转移至新的管中,这对于大量样品的同时抽提就不太方便。另外,还有一种更为简单的SDS处理方法。不过,似乎产量较低,结果重复性不太好。
方法改进:
由于酵母转化实验中常常使用醋酸锂(LiOAc)来弱化细胞壁,故我们决定将它与SDS结合,来开发一种从酵母中提取gDNA的快速、方法。
我们从YPD平板上挑了8个酿酒酵母的单克隆,重悬在100 µL 200 mM LiOAc和1% SDS的溶液中,并在70°C孵育15分钟。孵育之后,加入300 µL 96%乙醇,涡旋振荡混合样品,并以15000x g离心3分钟,收集DNA。将DNA沉淀溶解在100 µL TE中,通过短暂离心(15000x g,1分钟)去除细胞碎片,之后取1 µL上清进行PCR。
我们在不同的反应中扩增了两个不同的gDNA片段,大小分别为489 bp和2383 bp,并在0.9%的琼脂糖凝胶中分析了PCR产物。我们发现,通过LiOAc-SDS方法制备的所有样品都能扩增出两个片段。
结论:
我们开发出一种从酵母中提取gDNA的快速可靠方法,适用于3500 bp以下的DNA片段的扩增。整个过程可在15分钟内完成,不需要更换离心管,相当方便。液体和固体培养基的细胞都可使用。此方法适用于酵母重组子的快速筛选或酵母的常规基因分型。
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