细胞房细胞培养流程及废液抽吸装置
时间：2023-10-12 阅读：1159
内容大纲
细胞培养与废液抽吸
细胞培养流程
废液抽吸方法的比较法
细胞培养实验室基础设备
废液处理与废弃办法
什么是废液抽吸?
废液抽吸 (aspiration / suction) 为现代生物学技术中常用的技术，用以移除废弃液体。生物学中常见的细胞培养，是将真核或原核细胞培养于适宜的培养液 (culture medium) 及环境中，使其在受控制的状态下生长 (growth) 及增殖 (proliferation)的过程。 细胞培养的流程包含解冻细胞、培养 (cell culture)、继代培养 (俗称分盘，cell subculture) 及冷冻细胞等步骤。
然而，细胞生长过程中会产生代谢物、细胞碎片等废弃物影响细胞健康，甚至导致细胞凋亡 。因此在细胞培养过程中，需定期更换培养液，而移除旧有培养液、洗涤液的行为，则为废液抽吸。
真空废液抽吸装置 (suction system, aspiration system) 常见如上图，主要包含：
A. 真空瓶 (vacuum flask)
B. 缓冲瓶 (safety bottle)
C. 过滤器 (filter)
D. 真空源 (vacuum source)
连接并启动真空源后，细胞培养瓶/皿中的废液会因压力差而被抽吸、收集至真空瓶，缓冲瓶则做为防溢装置使用，以避免废液被抽吸至真空源内。过滤器可使用HEPA滤膜(High Efficiency Particulate Air filter 或 0.22 µm过滤器，以过滤掉废液及空气中的粒子、确保抽吸效率。
细胞培养流程
细胞培养前，请确认操作环境符合无菌操作条件，且应避免和细菌实验共享设备，以防污染。
1. 解冻细胞 (thawing cells)：将冷冻细胞以 37 oC 快速解冻、回温，以避免细胞损伤。
2. 培养 (cell culture)：依据细胞种类和浓度，将细胞和培养基均匀混合后，放入培养箱中培养。
3. 继代培养 (cell subculture)：当细胞生长至一定程度后，收集细胞，分殖于新的培养基中。
进行继代培养时，其依细胞种类不同，处理方式可分为以下两大类：
a. 附着型细胞 (adherent cell)，又称贴壁培养、单层培养 (monolayer culture)
· 去除旧培养基废液
· 以 Phosphate buffered saline (PBS) 洗涤细胞一至二次
· 加入 trypsin-EDTA溶液，于 37 oC 下作用 2~20 分钟，使细胞可自培养瓶/皿中脱落
· 加入含有血清的新鲜培养基中，以终止胰蛋白酶作用
· 将脱落的细胞及其团块打散、混合均匀后，收集所有液体
· 离心后移除上清液，并添加新鲜培养基，依稀释比例转移至新的培养瓶/皿中进行培养
b. 悬浮型细胞 (suspension cell)，又称悬浮培养 (suspension culture)
· 将细胞培养液以 1000 rpm 离心 5 分钟后，吸除上清液
· 加入适量新鲜培养基，与沉淀细胞混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶/皿中进行培养。
4. 冷冻细胞 (cryopreservation)：获得目标细胞株后，将细胞悬浮于含有 5~10 % DMSO (二甲基亚砜，dimethyl sulfoxide) 及 30~50% FBS (胎牛血清，Fetal Bovine Serum) 的新鲜培养液中，以 -80 oC 或液态氮等低温设备保存。
5. 细胞计数 (cell counting)：用以计算细胞浓度，可利用传统血球计数器 (Neubauer chamber) 或自动计数器 ，计算细胞浓度可用来判断目前细胞生长的情况。
废液抽吸方法的比较
废液抽吸目前有多种方法可以进行。 早期实验室多利用移液器(pipette)或电动吸管抽吸废液，然而因为需要重覆抽吸及排除液体，长时间使用下来易造成手部不适及疲劳。除此之外，电动吸管须搭配无菌刻度吸管使用，而现多使用抛弃式吸管排除污染疑虑，因此一次实验下来通常会产生大量废弃物，造成环境负担。
现代实验室则普遍会自行购置真空帮浦搭配真空瓶自行组装，如此会较电动吸管有效率，且设备取得较容易，然而自组式系统常见许多例如：管线配置不良，造成工作环境混乱、或是玻璃吸管经常破裂等安全性上的缺点。
Lafil 废液抽吸系统及 BioDolphin 废液抽吸套件主要为生命科学细胞培养或实验过程中溶液抽吸应用，可直接放置于无菌无尘操作台 (laminar flow) 使用。Lafil 废液抽吸系统整合真空源、真空瓶与废液抽吸套件，提供实验室一体化解决方案，更比传统废液抽吸系统减少一半台面占用面积，并使用围篱式平台固定真空瓶，避免操作者不小心碰触瓶身而倾倒。
洛科Lafil 废液抽吸系统及 BioDolphin 废液抽吸套件
实验室电动吸管 | 自组真空抽吸系统 | 洛科废液抽吸系统 | ||
Lafil 100 | Lafil 200 | |||
整合式设计 | 是，单一产品 | 否 | 是，一体化all-in-one设计 | |
抽吸耗材 | 无菌刻度吸管 | 吸管尖 (tip) | 吸管尖 (tip) | |
长时间操作 | 易造成手部肌肉疲劳 | 易造成手部肌肉疲劳 | 符合人体工学、单手退tip设计 | |
吸力调节 | 无 | 有 | 无 | 有 |
废液清除 | 每次抽吸排净 | 吸取至真空瓶满后清除 | 吸取至真空瓶满后清除 | |
真空瓶 | 无 | 通常为 1 L 抽气瓶 | 1 L PP瓶 | 4 L PP瓶 |
帮浦/设备保护 | 无 | 无 | 有 | |
废液溢漏危险 | 无 | 高风险 | 无 | |
置入无菌操作台 | 可 | 不可 | 可 | 不可 |
空间利用性 | 体积小 | 管路杂乱占空间 | 可省去自组系统50~65%空间 | |
环境友善 | 易产生大量抛弃式废弃物 | 易产生大量抛弃式废弃物 | 所有配件采用耐高温高压灭菌材质，另有节能安静的eco机种 | |
特殊需求 | 无 | 无 | Lafil 200：支援2人同时抽吸 | |
细胞培养实验室基础设备
无菌操作台，或生物安全柜 | 无菌操作台可作为实验室内的无菌工作区，同时也可遏止各种于微生物实验程序中可能产生的传染性飞溅物或气胶。 |
培养箱 | 使用培养箱的目的是为细胞生长提供舒适的环境。培养箱可透过控制温度、湿度和二氧化碳浓度提供细胞适合的生长条件。 |
废液抽吸系统 | 使用废液抽吸系统，可以更轻松地从细胞培养容器中吸除培养基和试剂。 |
光学显微镜 | 光学显微镜是细胞培养bu可或缺的工具，如正立显微镜、倒立显微镜。其将细胞可视化，以监测细胞生长情形、细胞形态、计数与识别污染物质。 |
低温储存设备 | 随着传代次数的增加，连续培养的细胞可能会出现遗传不稳定性，如遗传漂变、哀老； 因此将它们保存在低温储存设备中以供长期储存是细胞培养中重要的步骤。 |
水浴器 | 细胞实验室普遍会将水浴槽设置为37 oC，用于预热培养基以及解冻冷冻细胞或试剂等。 |
废液处理与废弃办法
含有危险化学品（如氯）之有机废液应收集至设有适当标示之专用废液桶，不含危险化学品之其它废液可一并收集于一般混合废液桶，废油则需收集于废油桶中。细胞培养用的废液应加入适当浓度的消毒剂，如漂白水(次氯酸钠Sodium Hypochlorite)，使细胞致死，再倒入水槽或废液桶。培养皿等生物医疗相关废弃物则应置于生物医疗废弃物袋中，进行高温高压灭菌后以一般废弃物丢弃，或是请依照我国生物医疗废弃物相关规定处理。
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