观察GFP和包括FITC在内的绿色荧光，都可以使用nightsea的体视显微镜荧光适配器(Stereo Microscope Fluorescence Adapter)，这毫无问题。我们经常遇到的问题是：是用下图中黄色的longpass滤光片好呢？还是选择绿色的bandpass滤光片好。

答案是：不能一概而论，常要视具体情况来做出选择。下文分析一下两者各自的优缺点。

  Longpass：可以透过任何超过~500nm波长的光

  Bandpass：透光波长以~530nm为中心，透光波长范围约~60nm。

就是说bandpass只能透过绿色光，而longpass可以透过的光包括了绿，黄，橙和红色。

滤光片有何作用？

滤光片就是用来强化预观察的荧光信号的：它能挡住(源于激发光源的)反射光，同时透过我们想观察的荧光信号。在实际观察中常常受到来自观测区域内其它潜在荧光信号的干扰（噪音），这类背景荧光信号可能来自培养基（线虫研究中常会有此问题），或是其它东西（例如植物叶绿素和发育中的斑马鱼的yolk发出的荧光信号）。

Longpass和bandpass在阻挡激发光上都没有问题。问题焦点是面对这些噪音信号，两者中哪个才是正确的选项？

如果背景信号和你要观察的信号在波长上不存在重叠，那应该选择bandpass滤光片。如下图所示，拟南芥（或其它植物）的叶绿素发出红色荧光，其波长峰值约为685 nm，bandpass可以将它过滤掉，这样就可以轻松观察GFP信号而不再受到它的干扰（*张显示longpass滤光片下存在信号叠加，第二张bandpass下只余下绿色荧光）。

拟南芥图片由波士顿大学John Celenza博士惠赠。

更多图片链接：http://www.nightsea。。ｃｏｍ/articles/green-bandpass/

但是，在所要观察的荧光信号与背景信号波长存在交叉叠加时，将背景信号过滤掉则可能引起问题。这时，使用longpass滤光片保留背景信号更好：可以通过信号的强度和颜色的对比来区分（哪是要观察的荧光信号，哪是背景信号）。下面是一条转荧光基因的斑马鱼图片。这条斑马鱼在心脏表达GFP，在血细胞表达mCherry。Longpass（上端）就可以将此区分出来，而bandpass（下端）就不能。上端图像可以呈现出清晰的绿色荧光心脏，红色荧光血细胞，还有yolk天然发出的黄色荧光。而在选择bandpass滤光片所获的图像里，满眼是强弱不等的绿色，这些绿色并不全是来自GFP的表达，因此容易造成混乱和误判。

斑马鱼图片由Williams大学Martha Marvin博士惠赠，该转基因斑马鱼由Buffalo大学Lara Hutson博士杂交培育。

有的情况下，则两种滤光片都可以。线虫培基可以呈现绿色荧光背景，同样是面对这一场景，有的观测人员倾向使用bandpass，有的倾向用longpass，前者认为bandpass比longpass增加了一些清晰度和对比度。总之，面对此种情景，个人偏好在zui终选择上起了关键作用。

如果是探索自然界的荧光信号，那没有疑问，应该选择longpass。选择bandpass的话，你可拍不出下图藿香蓟花的美妙来！

该文英文由Nightsea提供

http://www.nightsea。。ｃｏｍ/sfa-sharing/longpass-vs-bandpass-barrier/

该文由群晓科苑翻译，群晓科苑为nightsea授权代理商。

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