影响酶促反应的因素—温度、PH和抑制剂

目的要求

 通过本实验了解pH、温度、抑制剂对酶活力的影响。

实验原理

 酶作为生物催化剂与一般催化剂一样呈现温度效应。酶促反应开始时，反应速度随温度升高增快。达到zui大反应速度时的温度称为某种酶的zui适温度。由于绝大多数酶是有活性的蛋白质，当达到zui适温度后，继续升高温度，引起蛋白质变性，酶促反应速度反而逐步下降，以致*停止。

    酶的zui适温度不是一个常熟，与作用时间长短有关。测定酶活性均在酶促反应zui适温度下进行。大多数动物来源的酶zui适温度为37～40℃，植物来源的酶zui适温度为50～60℃。

    酶的催化活性与环境pH有密切关系，通常各种酶只在一定pH范围内才具有活性，酶活性zui高时的pH，称为酶的zui适pH。高于或低于此pH时酶的活性逐渐降低。

   酶的zui适pH不是一个特征物理常数，对于同一个酶，其zui适pH因缓冲液和底物的性质不同而又差异。

   在酶促反应过程中，抑制剂对酶的抑制作用可分为可逆抑制和不可逆抑制。可逆抑制有根据抑制剂和底物的关系分为三种类型：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。

   在本试验中，胰蛋白酶的zui适温度为37℃，zui适pH值为8.1.胰蛋白酶的抑制剂为苯甲脒，其抑制方式为竞争性抑制。

试剂和器材

1、试剂

5%三氯醋酸溶液。1mmol/L苯甲脒溶液：称取19.25g苯甲脒，用少量水溶解，定容至100mL。

1%酪蛋白溶液：取1g酪蛋白，加0.1mol/L氢氧化钠溶液10mL、水40mL，置60℃水浴加热至溶解，放置室温后，加水稀释成100mL，并调至pH8.0.

0.1mol/L硼酸缓冲液：

A液，0.1mol/L硼酸（H3BO3）：称取6.18gH3BO3溶于1000mL水中。

B液，0.025mol/L硼砂（Na2B4O7·10H2O）：

称取9.54g硼砂（Na2B4O7·10H2O）溶于1000mL水中。

pH7.4硼酸缓冲液：90mL A液+10mL B液

pH8.0硼酸缓冲液：70mL A液+30mL B液

pH9.0硼酸缓冲液：20mL A液+80mL B液

2、材料

胰蛋白酶溶液：50～200ug/mL，用0.1mol/L，pH8.0硼酸缓冲液配制。可用粗提的猪胰蛋白酶，用量根据实际测的比活值而定。

3、仪器

试管1.5cm×15cm（×19）；移液管1mL（×7），2mL（×3），5mL（×5）；量筒100mL（×1），恒温水浴；水浴90(0℃）；白瓷板；胶头滴管。

操作方法

1、温度对酶活力的影响

取3支试管，空白管：先在试管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液，摇匀后，再加入0.2mL酶液，0.8mL蒸馏水，在37℃保温10min。

将样品管和空白管分别离心，3000r/min，5分钟，取上清液于280nm处测定各管的吸光值，并比较之。

2、pH对酶活力的影响

取3支试管，空白管：先在试管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液，摇匀后，再加入0.2mL酶液，0.8蒸馏水，在37℃保温10min。

 将样品管和空白管分别离心，3000r/min，5分钟，取上清液于280nm处测定各管的吸光值，并比较之。

3、抑制剂对酶活力的影响

取3支试管，空白管：先在试管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液，摇匀后，再加入0.2mL酶液，0.8蒸馏水，在37℃保温10min。

将样品管和空白管分别离心，3000r/min，5分钟，取上清液于280nm处测定各管的吸光值。并比较之。

注意事项

1、由于胰蛋白酶活力不同，因此实验应随时检查反应进行情况。如反应进行的太快，应适当稀释酶液；反之，则应减少酶溶液的稀释倍数。

2、注意不要在检查反应程度时使各管溶液混杂。