还原糖和总糖含量的测定

（3,5-二硝基水杨酸比色法）

一、目的

掌握还原糖和总糖定量测定的基本原理，学习比色定糖法的基本操作。

二、原理

    还原糖和总糖含量的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，在分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

   还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其他产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕色红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光吸收值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、实验用品

（一）、实验材料。

面粉

（二）、器皿

1、25mL刻度试管×11

2、大塑料离心管×1

3、100mL烧杯×1

4、100mL容量瓶×1

5、移液管：1mL×2,2mL×2

6、恒温水浴锅

7、沸水浴

8、离心机

9、电子天平

10、分光光度计

（三）、试剂

1、1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。

2、3,5-二硝基水杨酸试剂：将6.3 g 3,5-二硝基水杨酸和262mL 2mol/L NaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，在加5g结晶苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌至溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，储于棕色瓶中备用。

四、操作步骤

（一）、制作葡萄糖标准曲线

    取7支具有25mL刻度的刻度试管，编号，加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。将各试管摇匀，在沸水中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容到25mL刻度处，用橡皮塞塞住试管口，颠倒混匀。在540nm波长下，用0号试管调零，分别读取1～6试管的吸光值。以吸光值为纵坐标，葡萄糖质量（mg）为横坐标，绘制标准曲线。

（二）、样品中还原糖含量的测定

1、样品中还原糖的提取

    准确称取3g食用面粉，放在100mL的烧杯中，先以少量蒸馏水搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。然后转入大塑料离心管中，4000r/min离心5min，上清液全部收集到100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。

2、总糖的水解和提取

    准确称取1g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL6mol/L HCI，置沸水浴中加热水解30min（水解是否*可用碘-碘化钾溶液检查）。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/L，NaOH中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。

3、显色和比色

    取4支25mL刻度试管，编号。分别加入待测夜和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号试管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。

五、附注

1、离心比过滤易得上清液

2、标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。