聚丙稀酰胺等电聚焦电泳

目的要求

1、学习等电聚焦的原理

2、掌握聚丙烯酰胺等点聚焦电泳操作技术

实验原理

    所有的氨基酸均为两性物质，即它们至少含有一個羧基（carboxyl）及一个氨基（a-ami-no）。 这些可游离的基团随着pH变化可以三种形式存在，即在电荷（cation）、两性离子（zwit-terion）及负电荷（anion）等三种，在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷。若氨基酸在某一pH值下其净电荷为0，且在电场中不移动时，称此pH值为它的pI值（等电点）。因为净电荷为零，净电斥力不存在的缘故，大部分蛋白质在等电点的pH值下，其溶解度zui小。相反的，当溶液的pH值低于或高于pI,所有蛋白质分子所带净电电荷为同号，彼此之间有相斥力，不会聚焦。所以，将pH调到等电点的大小，则大部分的蛋白质将会沉淀，这种现象可以应用于估算某蛋白质的等电点。另一方面，也可以应用在电泳，达到分离蛋白质混合物的目的，这种方法称为等电聚焦电泳（isoelectric  focusing），简称为IEF。

    以A、B两种蛋白质为例，做出它们的净电荷曲线图，横轴代表环境中的pH值，纵轴代表蛋白质的净电荷，在pH6.5时，A带有两个正电荷，B带有一个负电荷。使A与B的净电荷为0的pH值分别为pH9和pH5，这就是它们的等电点。

    IEF是在具有pH梯度环境中进行的电泳。将蛋白质置于不同pH梯度的胶体进行电泳，它会朝着与自身所带电荷相反的电极方向移动，直到抵达等电点（pI）相同的pH值处才停止，如果它移到别的pH处，会因为带电而再度移动到和它pI相符的pH处。

    IEF-PAGE操作简单，只要一般电泳设备就可进行，电泳时间短、分别率高、应用范围广，可用于分离蛋白质及测定pI，也可用于临床鉴别诊断、农业、食品研究等各种领域。

试剂和器材

1、试剂

    Acr-Bis贮存液：29.1g  Acr，0.9g  Bis，用无离子水溶解后定容至100mL，不溶物过滤去除后置棕色瓶，贮于冰箱。

   等电点标准蛋白（pH3～10）试剂盒，临用前稀释至0.1～0.3mg/mL。

   适合于pH3～pH10范围的电极溶液：

（1）、阴极电极溶液（1mol/L、NaOH）。称NaOH（AR）4g，加去离子水使其溶解，冷却至室温再定容至100mL。

（2）、阳极电极溶液（1mol/L、H3PI4）。取H3PO4（85%）6.7mL，加去离子水定容至100mL。

固定液：称取磺基水杨酸3.5g，三氯乙酸10mL，甲醇35mL，加去离子水至100mL。

染色液：称取考马斯亮蓝R250、0.1，冰乙酸10mL，甲醇35mL，加去离子水使其*溶解，再定容至100mL，过滤后置棕色瓶保存。

脱色液：取无水乙醇50mL，冰乙酸20mL，加蒸馏水至200mL。

保存液：取无水乙醇25mL，冰乙酸10mL，甘油5mL，加蒸馏水至100mL。

10%过硫酸铵，TEMED，40%两性电解质载体（pH3～10）。

2、材料

    待测已纯化的蛋白质样品（脱盐），浓度0.5mg/mL。

3、器材

    等电聚焦电泳槽，移液管（1，5,10mL），烧杯（25,50,100mL）细长头的吸管，微量注射器（10uL或者50uL），漏斗，滤纸，镊子。

操作方法

1、准备工作

    配制凝胶前，应把玻璃板准备好。即将两块干净的玻璃板叠放在一起，之间夹上所需凝胶厚度的胶条进行密封。然后用文具夹将玻璃板四周固定好。注意夹子作用力点在胶条正中，以防漏胶。

2、配制凝胶

    取Acr-Bis贮备液2.0mL；两性电解质0.5mL；去离子水5.5mL；TEMED  8uL置于小烧杯中混匀，再加入10%过硫酸铵50uL，用磁力搅拌器充分混匀2min。然后用注射器吸净混合液，排除气泡，缓缓注入玻璃板的夹隙内，注意勿出现气泡。

3、电泳

（1）、、剥胶板。将胶板取出，揭去上层的玻璃板和胶条，然后用蒸馏水轻轻冲洗一下胶面。

（2）、点样。用小纸条（0.5cm×0.5cm）蘸上，均匀地点在胶板上，点样要求整齐、迅速。注意胶板两边要留出一定空间。通常把p1在酸性范围的样品放在偏碱性的位置（负极），P1偏酸性的样品放在偏酸性的位置（正极），标准蛋白质混合样品放在中间。

（3）、进样。将浸入电极液的滤纸条取出，使其分别平直紧贴在胶面两端，然后放入电泳槽内，注意正负极相吻合。将电极板正极（电极条浸有H3PO4的一侧）与负极（电极条浸有NaOH的一侧)分别与电泳仪的正、负极链接。接通冷却水，在室温下电泳，把电泳仪调至电压50V，电流以每板胶不超过17mA为准，然后开始电泳。进样时间一般在1.5～2h。

（4）、揭样纸。待电流降至每板胶3mA以下时，切断电源，取出胶板，揭去加样纸后，将电压调至220～320V断续电泳。

（5）、加压。当电流降至每板胶3mA以下时，升高电压至580V，继续电泳1.5h左右。

（6）、电流降至每板3mA以下时，切断电源，停止电泳。

4、固定、染色和脱色

    将凝胶板放在培养皿中，加入固定液，浸泡数小时后，用脱色液清洗两次，每次10min，然后加入染色液，室温下放置15～30min，再用脱色液洗脱数次，直至谱带清晰，放入保存液中浸泡10min，可制干板。

5、制作干胶板

（1）、取*浸湿的平整玻璃纸一张，于玻璃板上铺平，纸与板之间不可有气泡。

（2）、将凝胶铺于上述玻璃纸上，对齐中心位置，使四边留出距离相等，随后将胶与纸之间的气泡轻轻赶跑。然后，把另一张玻璃纸折起盖在胶面上，并与下层玻璃纸对齐，胶与两层玻璃纸之间要避免气泡，要求光滑平整。

（3）、将凝胶四边上下两层玻璃纸贴紧，使胶边边缘上*没有气泡。然后将各边的玻璃纸多余部分折向玻璃板反面。

（4）、置于室温中自然干燥，*干燥后的胶板，手感如触及玻璃板。这时，可将胶板揭下，截去边角多余的纸，即可得一张图谱清晰的干胶板。

注意事项

（1）、支持介质。在IRF-PAGE中，丙烯酰胺纯度极为重要，Acr及Bis中如有丙烯酸，则引起聚焦后pH梯度漂移，一般需用重结晶法进一步纯化Acr及Bis。zui近，Pharmacia公司推出Amberlite MB-6除去丙烯酸，其效果较再结晶法更佳。

（2）、两性电解质载体。两性电解质载体是IEF-PAGE中zui关键的试剂，直接影响pH梯度的形成以及蛋白质的聚焦。因此，要选用的两性电解质载体，在凝胶中，其终浓度一般为1%～2%。pH梯度的线性依赖于两性电解质的性质，选择哪种pH梯度范围的两性电解质载体，则与被分离蛋白质的pI有关。

（3）、样品预处理与加样方法。实验证实，盐离子可干扰pH梯度形成，并使区带扭曲。为了防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用Sephadex  G-25脱盐，也可将样品溶解在水，或是低盐缓冲液中，使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾。但某些蛋白质在等电点附近，或水溶液及低盐溶液中，溶解度较低，则可在样品中加入两性电解质，如加入1%甘氨酸或对1%甘氨酸透析。虽然甘氨酸是两性电解质，但不影响pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶极距作用增加蛋白质的溶解性。此外，还可在样品及凝胶溶液中加入无离子去污剂如Tween 80，Triton  X-100，Nonide P-40等或加入相同浓度的尿素（4mol/L），以免氰酸盐引起蛋白质的氨甲酰化，含有尿素的样品及凝胶板只能当天使用。

     加样量取决于样品中蛋白质的种类、数目及检测方法的灵敏度。如用银染色，加样量可减少到1ug。一般样品浓度以0.5～3mg/mL为宜，zui适加样体积为10～30uL。如样品很浓，可直接在凝胶表面加2～5uL；如样品很稀，可加样300uL。值得注意的是：对不稳定的样品可先将凝胶进行15～30min预电泳，使pH梯度形成，然后将样品放再靠近pI的位置以缩短电泳的时间，但不要将样品正好加在pI处和紧靠阳、阴极的胶面上，以免引起蛋白质变性造成区带扭曲。一般加样电泳半小时后，取出加样滤纸以免引起拖尾现象。

（4）、电功率、时间等因素。在IEF电泳中，随着样品的迁移越接近pI时，电流则越来越小。为使各成分能更好地分离，要保持一定的电功率，就应不断增加电压，电压增高可缩短PH梯度形成，和蛋白质分离所需的时间，但过高的电压会使凝胶板局部范围过热。因此，在电泳过程中，应通冷却水，水温以4～10℃为宜，流量5～10L/min。一般宽pH范围电泳时间以1.5～2h为宜。