单向定量免疫电泳

目的要求

  了解单向定量免疫电泳的基本原理和方法

实验原理

    单向定量免疫电泳又称火箭电泳（rocket  immunoelectrophoresis）。在琼脂内掺入适量的抗体，在电场作用下，定量的抗原泳动遇到琼脂内的抗体，形成抗原-抗体复合物沉淀下来。走在后面的抗原继续在电场作用下向正极泳动，遇到琼脂内沉淀的抗原-抗体复合物，抗原量的增加造成抗原过量，使复合物沉淀溶解，一同向正极移动而进入新的琼脂内与未结合的抗体结合，又形成新的抗原-抗体复合物沉淀下来，不断地沉淀-溶解-再沉淀，直至全部抗原和抗体结合，在琼脂内形成锥形的沉淀峰，称火箭电泳。火箭峰的长度与标准抗原比较，可计算待测抗原的浓度。

    本实验以人血清作为抗原，免疫动物（家兔）产生抗血清，当适量抗原、抗体在琼脂糖中扩散，两者相遇时，则形成抗原抗体复合物的白色沉淀线。不同的抗原分子与相应的抗体分子的扩散速度不同，当两者间比例适当时，出现数目不同的沉淀线，根据沉淀线的出现可以定性抗原、诊断疾病或测定抗体的效价。

试剂和器材

1、试剂

    抗原：甲胎球蛋白（1～5mg/mL）。

    免疫血清（抗血清）：家兔抗人甲胎球蛋白血清。

    琼脂糖（或进口分装琼脂粉）。

    pH8.6电极缓冲液（巴比妥缓冲液）离子程度0.05u：取巴比妥1.84g，巴比妥钠10.3g溶于蒸馏水，定溶至1L。制备琼脂溶液时需要将上述缓冲稀释1倍，离子强度为0.025u。

2、器材

  载玻片、打孔器、微量取液器、稀释板、培养器或带盖培养皿。

操作方法

1、抗体琼脂板的制备

    将融化的琼脂冷却到55℃，加入适量（看免疫血清的效价高低而定）的抗体，立即混匀（不要出现泡沫），将上述的抗体琼脂（大约20mL）制成琼脂板，冷却后打孔备用。

2、加样

   在各孔里加入不同稀释度的抗原

3、电泳

    在平板电泳槽里倒进离子强度u=0.05的巴比妥缓冲液。将凝胶板平放在电泳槽中的隔板上。琼脂的两端用浸温的滤纸做桥与电泳槽的电极缓冲液相链接，抗体端接正极。通电，电流强度按琼脂板的宽度计算（1～2mA/cm）。观察到白色沉淀线时，即电泳完毕（一般1h左右）。一般通电后调电压为10V/cm，或电流强度为2～4mA/cm时间约1～5h。

4、定量抗原

    在电泳一定时间后可以观察到火箭状的白色沉淀峰。电泳完毕后可以用肉眼观察量出已知抗原量的各个火箭的高度，画出标准曲线，便可测出未知浓度的抗原量。如果计算的话，可用求积仪测定峰的面积。

注意事项

1、影响单向定量免电泳的因素很多，主要是要选择好抗体浓度，使抗原抗体浓度比例合适。这就需要根据免疫血清的效价来定所加入琼脂中的康体量，如效价高，则免疫血清琼脂的比列为1:5～9，如效价低，则免疫血清与琼脂的比列为2:5。

2、加入的抗体量要合适，以保证抗原、抗体的合适比例，以便形成清晰的沉淀峰。抗体的准确用量应通过预实验来决定，即加入不同量的抗血清，用一定量的抗原进行火箭电泳，选出沉淀峰在2～5cm之间的相应抗体浓度就是合适的抗体用量。