使用 Yoda-1 在体外模拟层流：一种简化药物测试的工具
时间：2022-04-19 阅读：751
内皮细胞（ECs）在血管稳态中起关键作用，包括调节血管张力、炎症和止血。正常循环中的内皮细胞受到包括剪切应力在内的血流动力学作用，这是一种平行于血管壁作用的摩擦力。
这些血流动力学可能会改善未来内皮细胞药物的发现或毒性筛选，并提高临床试验的成功率。已经开发了一系列方法来在体外对内皮细胞培养物施加剪切应力，包括平行平板流动室、锥板粘度计、轨道振荡器和微流体，每种方法都各有利弊。许多研究的一个重要缺点是在扩大高通量筛选方面面临挑战。Piezo-1，一种由剪切应力激活的钙离子通道，被确定为血管机械转导的关键参与者。在许多研究中，Piezo-1 的敲除或部分去除导致内皮未能与流动方向对齐。Piezo-1 可以通过小分子 Yoda-1 在体外和体内环境中被选择性地激活。目前，尚未描述 Yoda-1 的脱靶相互作用。在体外实验中，Yoda-1 的急性给药模拟了剪切应力的作用，激活了内皮细胞中的一氧化氮合酶，并诱导了离体动脉的血管舒张。
英国剑桥大学药理系的课题组在一项研究中调查了静态培养中的 Yoda-1 处理是否可以模拟层流剪切应力对内皮细胞炎症的影响，以及化疗药物阿霉素对内皮细胞毒性的反应。研究发现，Piezo-1 的药理学激活可能是一种模拟静态培养中恒定剪切应力的有用方法，这可能会改善内皮药物的发现和毒性测试。
将 Yoda-1 对 HUVEC 静态培养 24h 的影响与同时在层流条件下培养 HUVEC 的影响进行比较。
恒定剪切应力（5 dyn/cm2）下的培养使 ICAM-1 的表面表达量平均增加 1.77 ± 0.19 倍，但 VCAM-1 没有增加。Yoda-1 处理 24h 模拟了这种反应，诱导 浓度依赖性的 ICAM-1 表面表达的增加。1 μM Yoda-1 将 ICAM-1 水平显著提高至比对照组高 1.45 ± 0.11 倍。VCAM-1 表面表达不受影响。通过总 ATP 水平测量，这段时间的 Yoda-1 处理对 HUVEC 活力没有影响。然而，高于 10 μM 的浓度会在 4h 后导致很大比例的细胞死亡。通过共聚焦显微镜进行的平行细胞活力测试证实，高达 2 μM 的 Yoda-1 是无细胞毒性的。HUVEC 与 Yoda-1（0.05–2 μM）的孵育在该浓度范围内对细胞增殖没有影响。此外，还比较了 Yoda-1 和层流剪切应力（5 dyn/cm2）对促炎细胞因子 TNF-α 反应的影响。HUVEC 在层流下培养 20h，然后用 TNF-α（100 U/ml）再刺激 4h，也在层流下。或者，HUVEC 用 Yoda-1 处理 20h，然后在 Yoda-1 持续存在下用 TNFα 刺激 4h。Yoda-1 处理再次模拟了剪切应力的影响。实验还证实，该浓度的 Yoda-1 还模拟了层流剪切应力对内皮一氧化氮合酶（eNOS）及其上游激酶 Akt 磷酸化的影响。层流剪切应力（5 dyn/cm2）或静态培养的 1 µM Yoda-1 处理的 HUVEC裂解物中 eNOS 和 Akt 的磷酸化水平没有显著差异。
最后，为了测试 Yoda-1 处理是否可以模拟层流剪切应力对药物毒性的影响，实验研究了化疗药物阿霉素的作用。阿霉素以浓度依赖性方式降低在静态条件下培养的HUVEC的活力。
HUVEC 在剪切应力下培养 24h，然后用化疗药物（或对照药物）在持续剪切应力下再处理 24h。作为比较，HUVEC 也在非常低剪切条件下（0.5 dyn/cm2，每2h培养 1min，以允许更换培养基）培养。有趣的是，与低流动条件下的剪切应力相比，5 dyn/cm2 下阿霉素的细胞毒性增加了，仅剩下 16.0 ± 2.5% 的细胞核。HUVEC 用 Yoda-1 处理 24h，然后用化疗药物处理 24h（持续存在 Yoda-1）。同样，与 DMSO 对照组相比，在 Yoda-1 存在下阿霉素的细胞毒性增加。因此，这些数据表明，Yoda-1 处理可以模拟恒定剪切应力对阿霉素细胞毒性的影响。
总之，该研究已经证明 Piezo-1 的小分子激活剂 Yoda-1 可用于模拟静态培养中内皮细胞中的剪切应力。Yoda-1 模拟了静脉剪切应力对炎症细胞粘附分子 ICAM-1 和 VCAM-1，以及对血管损伤性化疗药物阿霉素的细胞毒性，这为改善内皮药物筛选提供了一种快速简单的方法。参考文献：Davies JE, Lopresto D, Apta BHR, Lin Z, Ma W, Harper MT. Using Yoda-1 to mimic laminar flow in vitro: A tool to simplify drug testing. Biochem Pharmacol. 2019 Oct;168:473-480. doi: 10.1016/j.bcp.2019.08.013. Epub 2019 Aug 19. PMID: 31437459; PMCID: PMC6852096.
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