SIRT1 activation promotes bone repair by enhancing the coupling of type H vessel formation and osteogenesis

KWS：SIRT1；bone repair；type H vessel formation；osteogenesis

骨缺损可由感染、肿瘤切除或外伤引起，潜在的严重后果包括骨折和畸形。目前，自体骨移植、牵引成骨和膜诱导再生技术是治疗骨缺损常用的方法。然而，这些方法可能无法实现令人满意的愈合，部分原因是血管再生不足。

最近的研究发现，H型血管是一种高表达血小板内皮细胞粘附分子1（CD31）和内皮粘蛋白（EMCN）的特异性毛细血管亚型。通过介导血管生成-成骨耦联机制，这种毛细血管亚型可维持骨稳态。此外，H 型血管的缺失也会抑制再生组织中的成骨，其受 H 型血管中骨祖细胞增殖和分化的调节。成骨和血管生成耦联涉及多种细胞因子及信号通路，包括血小板源性生长因子BB、低氧诱导因子-1α、Notch信号通路、血管内皮生长因子等。然而，目前尚不清楚调节因子是否增强了 H 型血管和成骨之间的耦联功能以进一步促进骨修复。

Sirtuin 1（SIRT1）是一种 NAD（+）依赖性脱乙酰酶，调节内皮功能并维持内皮稳态。此外，SIRT1 控制血管生成过程中内皮细胞（ECs）的血管生成活性。以往研究报道，SIRT1 激活剂的持续释放通过调节成骨细胞/破骨细胞分化来恢复不平衡的骨稳态。然而，SIRT1 是否调节骨缺损中的 H 型血管仍有待阐明。

最近，华西-国家口腔疾病临床医学研究中心的课题组进行了深入探索，假设 SIRT1 在 H 型血管生成中起调节作用，影响骨缺损的愈合。为了检验这一假设，研究人员构建了 HUVECs 和成骨细胞的体外共培养系统，探讨了 SIRT1 的激活或抑制对 HUVEC 血管生成和成骨特性的影响；还评估了 SIRT1 活性对小鼠股骨和下颌骨缺损中 H 型血管和成骨作用的影响。研究结果确定了通过 H 型血管增强骨修复的创新且可行的靶点。该研究发表于Cell Proliferation 期刊题为“SIRT1 activation promotes bone repair by enhancing the coupling of type H vessel formation and osteogenesis”。

首先，CCK8 测定显示，SRT1720（SIRT1激活剂）处理促进了 HUVEC 增殖，而EX527（SIRT1抑制剂）处理则具有相反的效果。划痕伤口愈合实验的结果表明，SIRT1 激活增加了 HUVEC 迁移，而 SIRT1 抑制则具有相反的效果。定量分析结果表明，SRT1720 处理时细胞迁移显著增加，EX527 处理后细胞迁移减少。此外，SIRT1 活化的 HUVECs 在基质胶上形成了更多的管状结构和分支，而抑制 SIRT1 会削弱这种能力。还观察到 SIRT1 活性水平与 CD31、EMCN 和 VEGF 表达之间存在正相关性。这些数据表明，激活SIRT1 增强了 HUVECs 的增殖、迁移和血管生成。

随后，根据初步结果，研究人员利用 SRT1720 和 EX527 来检查 SIRT1 激活或抑制对共培养系统中细胞血管生成和成骨能力的影响（图1 A）。

关于血管生成，观察到直接共培养导致血管网络的自发形成，即使在没有基质胶的情况下也是如此。免疫荧光染色显示，CD31 高表达，表明该网络主要由 HUVECs 形成。SIRT1 激活显著增强了共培养系统中血管网络的形成，而 SIRT1 抑制则减少了血管生成（图1 B、C）。此外，血管生成基因和蛋白（VEGF、CD31、EMCN 和 HIF1A）的表达在 SIRT1 激活后增加（图1 D、E），且观察到血管生成因子 SLIT3 的分泌量也显著增加（图1 F）。

ALP 和 ARS 染色实验的结果表明，SIRT1 激活显著增强了共培养系统的成骨能力（图1 G）。此外，成骨因子（ALP、RUNX2、OSX 和 COL1A）的表达水平增加，而抑制 SIRT1 削弱了系统的成骨能力（图1 H、I）。此外，培养基中 HUVECs 衍生的 TGF-β 浓度显著增加，SIRT1 激活进一步放大了这种效应（图1 J）。然而，激活或抑制SIRT1 均未观察到成骨细胞成骨能力的显著增强。这些数据表明，激活SIRT1 在体外促进 HUVEC/成骨细胞共培养系统的血管生成和成骨能力。

图1   SIRT1激活增强了HUVEC/成骨细胞共培养系统的血管生成和成骨能力。  

免疫印迹试验结果显示，共培养增加了与磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT/叉头框转录因子O1（FOXO1）通路相关的蛋白质的磷酸化水平，而在激活或抑制 SIRT1 后，磷酸化水平分别进一步增强或减弱。siRNA 转染后，AKT 在共培养系统中的表达显著降低，且血管生成相关基因和蛋白质的表达也明显减少。共培养系统中的血管网络数量也减少了。此外，ALP 染色显示，在 si-AKT 转染后，共培养系统的成骨能力降低，与成骨相关的基因和蛋白质的表达显著降低。这说明，PI3K/AKT/FOXO1信号通路介导 SIRT1 在 HUVEC/成骨细胞共培养系统中的作用。

为了提供进一步的证据支持 SIRT1 在骨愈合中的作用，实验诱导小鼠股骨或下颌骨的骨缺损，然后用 SRT1720 或 EX527 处理（图2 A）。值得注意的是，激活的SIRT1 在不同时间点显著促进骨缺损愈合，而抑制 SIRT1 会减缓股骨和下颌骨的这一过程（图2 B-E）。对于股骨，定量分析显示，SRT1720处理组在 14 天时仅在骨小梁数（Tb.N）和骨小梁分离度（Tb.Sp）的骨愈合参数值上存在显著差异，其他测量值之间无显著差异（图2 C）。此外，下颌骨中骨体积分数（BV/TV）、Tb.Sp 和骨小梁厚度（Tb.Th）在 SRT1720处理后 14 天也存在显著差异，而其他指标未观察到差异（图2 E）。与这些发现一致，HE 和 Masson 的骨缺损三色染色也表明，SRT1720处理促进了新骨的形成和成熟（图2 F、G）。这些数据表明，SIRT1 的激活促进股骨和下颌骨缺损后的骨愈合。

图2    SIRT1激活促进股骨和下颌骨缺损的骨愈合。

免疫荧光染色显示，SRT1720 处理显著促进了股骨缺损中 H 型血管系统的生成，而 EX527 则阻碍了这一过程。在第 7 天和第 14 天之间，定量分析显示，H 型血管标志物的表达存在显著差异。对于与骨缺损附近的 H 型血管共表达的成骨因子，如 ALP 和 RUNX2，SIRT1 激活显著增加了它们的表达，而 SIRT1 抑制则具有相反的效果。

在下颌骨缺损中，SIRT1 活化也与 H 型血管呈正相关。此外，SRT1720处理组下颌骨缺损中 ALP 和 RUNX2 的表达显著升高。然而，在 EX527 处理组中，观察到 RUNX2 表达存在显著差异，而非ALP 表达。

缺氧诱导因子1a（HIF1A）表达与 H 型血管的形成密切相关。SIRT1 的激活上调了骨缺损部位的 HIF1A 表达（图3 A、B）。在股骨缺损中，HIF1A 表达与 SIRT1 活性之间存在良性关联（图3 C）。在下颌骨缺损中，HIF1A 表达在初期较高，后期降低，这与在 H 型血管形成中观察到的变化一致（图3 D）。此外，SIRT1 激活显著增加了骨缺损中 p-AKT 和 p-FOXO1 的表达（图3 E-H）。以上数据表明，SIRT1 的激活通过 PI3K/AKT/FOXO1 通路增强骨缺损中 H 型血管和成骨/血管生成因子的耦联。

图3    SIRT1的激活通过AKT-相关通路促进HIF1A在股骨和下颌骨缺损中的表达。

图4    SIRT1 的激活增强了 H 型血管生成与成骨的耦联，通过 PI3K/AKT/FOXO1 信号通路促进骨修复。抑制 SIRT1 会削弱血管和骨形成，突出了 SIRT1 在耦联过程中的关键作用。

总之，这项研究利用体外共培养系统和骨缺损模型为 SIRT1 在 H 型血管发育和骨修复中的功能提供了重要见解。它还为 SIRT1 激活剂在促进骨愈合中的临床应用提供了更多的实验证据。然而，为了充分阐明这些过程的潜在机制并研究 SIRT1 在临床环境中的治疗潜力，未来有必要进行更深入的研究。

参考文献：Liu Z, Liu H, Liu S, Li B, Liu Y, Luo E. SIRT1 activation promotes bone repair by enhancing the coupling of type H vessel formation and osteogenesis. Cell Prolif. 2024 Jun;57(6):e13596. doi: 10.1111/cpr.13596. Epub 2024 Jan 11. PMID: 38211965; PMCID: PMC11150139.

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