miR-342-5p downstream to Notch enhances arterialization of endothelial cells in response to shear stress by repressing MYC

Keywords: MT: Non-coding RNAs; Notch; arterialization; endothelial cell; miR-342-5p; shear stress.

血管生成，是指从已有血管发展形成新的血管，涉及内皮细胞（ECs）的增殖、分化和迁移。在生长的血管新生芽融合后，内皮细胞获得动脉表型并进一步成熟，最终形成一个稳定的分级血管网络，通过动脉化的过程灌注组织。

遗传程序和环境因素都参与 EC 动脉化，如血流诱导的剪切应力、血管内皮生长因子受体（VEGFR）信号和 Notch 信号。以往研究报道了 ECs 中 Notch 下游的 miRNAs，发现激活Notch 信号至少部分通过 miR-218-5p 下调 MYC 基因表达以抑制细胞周期进程，靶向异质核核糖检查蛋白A1（HNRNPA1）和眼缺失同源物3（EYA3）。miR-342-5p 是另一种抑制 EC 增殖和血管生成的 Notch 下游 miRNA。研究证明，在 EC 中，miR-342 可以被层流剪切应力上调。然而，剪切应力对 miR-342 的上调是否由 Notch 信号介导，以及 miR-342 在通过 Notch 信号介导机械转导以促进 EC 动脉化中的作用尚不清楚。

鉴于此，空军军医大学基础医院韩骅教授/晏贤春副教授及西京医院刘晓渭教授团队合作在Molecular Therapy Nucleic Acids 期刊发表了题为“miR-342-5p downstream to Notch enhances arterialization of endothelial cells in response to shear stress by repressing MYC”的研究成果。该研究评估了剪切应力、Notch 信号和 miR-342 之间的关系及其在促进 EC 动脉化中的下游机制。通过在确定流动条件下培养的 EC、新生视网膜血管生成和后肢缺血模型，miR-342 被鉴定为一种机械 miR，通过靶向 EYA3 减弱 MYC 表达来促进 EC 动脉化并改善血流灌注，从而稳定 MYC。这些结果提供的见解将有助于优化缺血性疾病的血管再生。

首先，使用体外层流对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）施加15 dyn/cm2剪切应力持续12或24 h以研究miR-342是否对血流诱导的剪切应力（FSS）做出反应。与在静态对照 HUVECs 相比，FSS 条件下miR-342 及其宿主基因 EVL 显著上调。FSS 始终激活 Notch 信号，并上调 miR-342 和 EVL，这可以被 Notch 抑制剂（DAPT）消除。这表明，剪切应力通过激活 HUVECs 中 Notch 上调 miR-342 表达。基因集富集分析（GSEA）和热图分析显示，在静态培养的 HUVECs 中，miR-342 过表达上调了剪切应力相关基因特征，如 KLF2 和 KLF4。但miR-342 表达降低的 HUVECs 在FSS下无法平行排列，阻断miR-342 在LSS下显著下调 KLF4 和 KLF2 的表达。这些结果表明，miR-342 介导 ECs 对 FSS 的反应。

FSS 激活 Notch 信号，从而上调动脉标志物。与此一致的是，在 FSS 下过表达 miR-342 的 HUVECs 也表现出动脉标志物（包括EFNB2、GJA4、GJA5和HEY2）表达的显著增加及静脉标志物（包括EPHB4、NRP2和NR2F2）表达的减少，静态对照组则呈现相反的效应。体内荧光原位杂交（FISH）染色显示，miR-342 阳性信号主要位于肾脏、肝脏和肺组织的动脉中。这表明，miR-342 介导剪切应力对动脉基因表达增强的影响。

进一步利用Matrigel栓塞试验检测血管生成情况，免疫染色显示，miR-342 显著增加 EC 标志物 CD31 和动脉标志物 GJA4 或血管平滑肌细胞（vSMC）标志物 α-SMA 的共定位，表明动脉标志物表达和 vSMC 覆盖率增加（图1 A、B）。

在视网膜血管生成模型中，miR-342 水平也显著增加。IB4 与 α-SMA 的免疫染色表明，伴随着血管密度降低，miR-342 的上调显著增加视网膜血管中的 α-SMA⁺ vSMC，表明 vSMC 覆盖率增加，这是动脉化的标志（图1 C）。qRT-PCR显示，在注射 miR-342 的视网膜中动脉标志物表达增加，而静脉标志物显著降低。相比之下，玻璃体内注射 miR-342 拮抗剂显著降低了 α-SMA⁺ vSMC 覆盖率，而视网膜血管密度略有增加（图1 D）。这些结果表明miR-342 在体内促进动脉化。

图1    miR-342在体内增强EC动脉化。

接下来，评估了 miR-342 与 FSS 在 EC 动脉化调节方面的关系，发现阻断 miR-342 部分消除了 FSS 诱导的动脉标志物上调，这表明，miR-342 介导 FSS 诱导的 ECs 中动脉标志物的上调。触发 Notch 激活发现其在 mRNA 和蛋白质水平上上调动脉标志物并下调静脉标志物，但敲低 miR-342 减弱了这些影响。值得注意的是，miR-342 的敲低通过 Dll4 触发的 Notch 激活减弱动脉化。这些结果表明，miR-342 在 FSS 触发的 Notch 激活下介导 EC 动脉化。

MYC 基因是一种原癌基因，它主要参与细胞分裂和增殖过程。Notch 活化通过抑制 MYC 依赖性代谢和细胞周期活动来促进 EC 动脉化。miR-342 过表达显著抑制 MYC 调节因子和细胞周期进程相关基因。一致地，在转染 miR-342 模拟物的 HUVECs 中，细胞周期进程减慢。这表明，miR-342 可能通过抑制 MYC 表达来减弱 EC 细胞周期进程。

进一步验证 MYC 在 miR-342 诱导的 EC 动脉化中的作用，发现 MYC 表达在 FSS 和 Notch 激活下降低。同样，miR-342 过表达显著下调 HUVECs 中 MYC 的 mRNA 和蛋白水平（图2 A、B），相比之下，miR-342 敲低上调了两者水平（图2 A、C），而阻断miR-342 消除了 Notch 激活对 MYC 表达的抑制。这些结果表明，miR-342 通过被 FSS 触发的 Notch 活化介导对 MYC 的抑制。

此外，MYC 过表达显著促进了细胞周期进程（图2 D、E），且消除了 miR-342 过表达诱导的 EC 动脉化，多种动脉标志物的 mRNA 和蛋白表达被抑制，而静脉标志物的表达得到恢复（图2 F、G）。这些结果证实 miR-342 通过抑制 MYC 增强动脉化。

图2     MYC 过表达消除了 miR-342 诱导的 EC 动脉化。

生物信息学分析表明MYC不是miR-342的直接靶点，然而，通过蛋白磷酸酶2A（PP2A）去磷酸化Thr58和Ser62来增加MYC蛋白稳定性的EYA3的3'-UTR含有miR-342识别位点。进一步研究表明，EYA3 过表达消除了 miR-342 过表达诱导的 MYC 的 Thr58 磷酸化和 Ser62 去磷酸化，并增加了 HUVECs 中 MYC 蛋白水平。此外，EYA3 过表达消除了 miR-342 诱导的 EC 动脉化。这些结果表明，miR-342 通过直接靶向 EYA3 下调 MYC 来促进 EC 动脉化。

EC 动脉化是缺血性损伤后血管灌注的重要步骤。最后，为了评估 miR-342 是否可用于改善组织缺血后的血管灌注，实验通过结扎小鼠建立了后肢缺血模型。结果显示，miR-342 与其宿主基因Evl在结扎的股动脉中的表达显著降低。FISH 染色进一步表明，结扎侧 ECs 中 miR-342 的表达显著降低（图3 A）。然后，在多侧肌肉注射 miR-342 激动剂，结果显示，其在损伤后第 7 天和第 14 天显著改善了血管灌注（图3 B）。此外，在 CD31+ ECs 中，与未结扎组相比，结扎后 GJA4 表达以及 CD31+ ECs 和 α-SMA+ vSMCs 的共定位显著下调，而 miR-342 注射显著改善了下调的动脉化（图3 C、D）。这些结果表明，局部 miR-342 注射可能通过增强缺血性疾病中的 EC 动脉化来促进血管灌注。

图3    在后肢缺血模型中miR-342 促进 EC 动脉化并增加血流灌注。

图4    图形概要

miR-342-5p通过靶向EYA3抑制MYC，介导剪切应力和Notch激活对促进EC动脉化的影响，这在缺血性疾病的治疗中具有潜力。

总之，该研究结果揭示了剪切应力和 Notch 信号介导的内皮动脉化的潜在机制，即 miR-342 充当介导剪切应力-Notch 信号轴的机械 miR，通过直接靶向 EYA3 下调 MYC 来促进内皮动脉化。因此，miR-342 可能是治疗缺血性疾病的潜在靶点。

参考文献：Zhang X, Sun J, Zhang P, Wen T, Wang R, Liang L, Yang Z, Li J, Zhang J, Che B, Feng X, Liu X, Han H, Yan X. miR-342-5p downstream to Notch enhances arterialization of endothelial cells in response to shear stress by repressing MYC. Mol Ther Nucleic Acids. 2023 Apr 4;32:343-358. doi: 10.1016/j.omtn.2023.03.022. PMID: 37128275; PMCID: PMC10148082

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