知无不“研“ | ChIP实验基础攻略
时间：2021-10-14 阅读：2982
对一个实验室新手来讲，提到ChIP，您可能没听过这个词，他的全称叫染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation),今天就带大家来学习一下CHIP实验的相关知识，咱们主要从CHIP的定义、原理、步骤以及应用以下几点给大家分析介绍，希望能帮助大家更好的做CHIP实验
在活细胞状态下，通过甲醛固定DNA-蛋白质复合物后，采用微球菌核酸酶（Micrococcal Nucleas）（注：早期使用的超声已经被淘汰了，不推荐使用）随机切断DNA，形成一个个一定长度范围内的染色质小片段，随后通过抗原-抗体特异性结合反应富集、沉淀这些小片段，然后通过对NaC、蛋白酶K解除蛋白质和DNA的交联，分离蛋白，纯化DNA，最后采用PCR检测DNA的序列信息，获取更多信息。
从上面的原理就可以看出，ChIP实验步骤大致可分6步：
（1）1%甲醛处理使蛋白质与 DNA 交联 ；
（2）细胞裂解，采用微球菌核酸酶消化形成染色质小片段；
（3）抗原-抗体反应，促进免疫沉淀反应；
（4）NaCl、蛋白酶 K 处理，解除DNA-蛋白交联；
（5）DNA 纯化回收；
（6）采用1.8%琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR对DNA作进一步分析。
甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。
基本的ChIP 实验包括五个步骤（如下图），分别是交联、染色质片段化、免疫沉淀、DNA 回收和纯化以及分析 DNA。由于实验材料的不同，可能会造成在交联和染色质片段化方面存在一些不同，需要不断优化条件，才能得到高质量的 DNA 从而进行后续的 ChIP 分析。
一般采用1% formaldehyde（甲醛）室温交联10-30分钟，交联的目的是为了建立蛋白质/DNA之间的稳定共价连接，这个过程要注意一下几点。（1）一定要使用新鲜甲醛溶液，因为甲醛容易被氧化，导致交联不充分，在后续染色质剪切的时候则容易破坏蛋白和DNA的共价连接。（2）交联的时间10-30分钟，如果研究对象为转录因子等丰度比较高，和DNA结合也很稳定，交联10min即可，如果研究对象为转录辅因子等丰度比较低，也不是直接与DNA结合，则适当延长交联时间至30min。
根据染色质剪切方式的不同，目前市面上提供两种试剂盒，酶解法和超声法的试剂盒。
酶解法则是在交联处理之后，加入适量的核酸酶特异性的切割核小体，将核小体切割成以1个、2个……核小体为单位的片段。到这里，有些小伙伴可能就摩拳擦掌准备接下来的免疫沉淀了，但是小优提醒您，酶解之后，样品并没有*切割好，还需要经过短暂的超声处理，把细胞膜和核膜充分打碎，使染色质片段*释放出来。
如果是超声法，则比较简单了，调整到合适的超声功率，将样品超声处理适当的时间就好了。在这个过程中要摸索好超声的条件，过度超声有可能破坏染色质完整性，会给ChIP实验富集带来负面影响，尤其是转录因子和辅因子。
向样品中加入抗体将目的蛋白和连接的DNA拉下来。这个过程中引入protein G微珠，将目的蛋白和与它结合的DNA拉下来，这个过程中或多或少也会把其他杂蛋白一起拉下来，所以接下来进行高盐和低盐的洗脱，去掉杂质。
在这个过程中选择合适的抗体对实验结果至关重要。如果您需要做测序，则要选择ChIP-seq级的抗体，如果只是做PCR，选择ChIP级抗体即可。因为ChIP级抗体除了要结合*裸露的靶蛋白之外，还要结合因构象变化被DNA遮蔽的抗原表位，而ChIP-seq则需要检测全基因组上大量的成千上万的基因位点。所以要严格选择相应级别的抗体。
用蛋白酶K解交联，消化染色质的蛋白质组分和DNA之间的连接，然后经过DNA纯化柱对样品进行纯化。
纯化好的DNA进行PCR或者测序分析。
利用 ChIP 检测特定的转录因子在基因组中的结合位置及序列，可发现下游基因的顺式调控元件，从而帮助完善转录因子参与的分子通路。
ChIP 可用于检测 RNA 聚合酶II以及其他转录组分的结合位点，从而发现启动子和增强子的序列，同时也可能发现新的转录调控机制。
ChIP 研究在组蛋白密码的发现和表征方面起着关键的作用，通过 ChIP 可发现组蛋白特异性修饰的水平，同时也可明确组蛋白的修饰对基因的调控作用。