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麦类条斑病菌PCR试剂盒
Cephalosporium gramineum PCR Kit
产品简介:
荧光定量 PCR 是检测传染性疾病的主流技术,本产品就是以染料法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测麦类条斑病菌的试剂盒。
产品特点:
1. 即开即用,用户只需要提供病毒 DNA 模板。
2. 引物经过优化,灵敏性高。
3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4. 特异性高,引物是根据麦类条斑病菌高度保守的 VP1 区设计。
5. PCR mix 中含上样染料,PCR 后可以直接上样电泳。
产品名称 | 方法 | 规格 | 价格 |
麦类条斑病菌LAMP试剂盒 | LAMP | 50次 | 2490元 |
麦类条斑病菌 PCR试剂盒 | PCR | 50次 | 1490元 |
麦类条斑病菌染料法荧光定量PCR试剂盒 | 染料法 | 50次 | 2490元 |
麦类条斑病菌探针法荧光定量PCR试剂盒 | 探针法 | 50次 | 2990元 |
麦类条斑病菌PCR试剂盒包装规格及成分:
编号 | 成分 | 规格 |
试剂一 | 2×PCR MagicMix | 0.5 mL(棕色) |
试剂二 | 荧光 PCR 模板稀释液 | 1 mL(黄盖) |
试剂三 | 麦类条斑病菌PCR 引物混合液 | 100 μL(白盖) |
试剂四 | 麦类条斑病菌PCR 阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) | 50 μL(红盖) |
试剂五 | DNA 病毒裂解液试用装 | 15 次(9 mL) |
试剂六 | 使用手册 | 1 份 |
运输及保存:低温运输,-20℃保存,有效期一年。
自备试剂:DNA 模板
使用方法:
一.稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。
1.标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液,用带芯枪头,下同)。
3.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二.样品 DNA 的制备
7.如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 上步制备的标准曲线样品的第 4 号(浓度为 1×10E4 拷贝/μL,10μL 相当于 1 万拷贝)或第 5 号(浓度为 1×10E5 拷贝/μL,10μL 相当于 10 万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要 200μL 样品,则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。
8.用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 94℃ | 5 min |
PCR 反应 (35 个循环) | 94℃ | 0.5 min |
50℃ | 0.5 min(采集 SYBR 通道的 荧光信号) | |
72℃ | 0.5 min | |
后延伸 | 72℃ | 10 min |
三、设置 qPCR 反应(20 μL 体系,在样品制备室进行)
9.如果只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于标准曲线样品。如果做 2-3次重复,则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。
10.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加):
成分 | 样品管 N+2 个 | PCR 阴性 对照管 | 标准曲线 样品管(2-7 管) |
2×qPCR MagicMix (棕色管) | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
麦类条斑病菌PCR 引 物混合液(白盖) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
自备 10×ROX (见注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
待测样品 DNA 模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
第 7 步所得标准曲线样 品稀释液(2-7 号) | 不加 | 不加 | 各 6μL(2 号样到 2 号管,3 号样到 3 号管…) |
11.盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR(具体 PCR 参数可以根据仪器不同 而自行优化)。
四、荧光定量 PCR 反应参数
五、数据处理
12.以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。
六、电泳检测
13.如果有必要电泳确认,可取 10-20 uL PCR 产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产 物的大小为 400 bp。
荧光定量PCR结果分析:
一般而言,荧光扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化;在平台期,扩增产物已不再呈指数级增加,PCR终产物量与起始模板量之间没有线性关系,无法计算起始模板拷贝数。因此只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,故选择在这个阶段进行定量分析。为了定量方便,在实时荧光定量 PCR 技术中引入了几个重要的概念:扩增曲线、荧光阈值、CT值。