弗氏柠檬酸杆菌PCR试剂盒

Citrobacter freundii PCR Kit

产品简介：

荧光定量 PCR 是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测弗氏柠檬酸杆菌的试剂盒。

产品特点：

1. 即开即用，用户只需要提供病毒 DNA 模板。

2. 引物经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据弗氏柠檬酸杆菌高度保守的 VP1 区设计。

5. PCR mix 中含上样染料，PCR 后可以直接上样电泳。

弗氏柠檬酸杆菌PCR试剂盒包装规格及成分：

运输及保存：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂：DNA 模板

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使用方法：

一.稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。

1.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液，用带芯枪头，下同）。

3.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二.样品 DNA 的制备

7.如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的标准曲线样品的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或第 5 号（浓度为 1×10E5 拷贝/μL，10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要 200μL 样品，则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。

8.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。​

三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

9.如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做 2-3次重复，则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。

10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加）：

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同 而自行优化）。

四、荧光定量 PCR 反应参数

五、数据处理
12.以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

六、电泳检测 
13.如果有必要电泳确认，可取 10-20 uL PCR 产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产 物的大小为 400 bp。

荧光定量PCR结果分析:
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化;在平台期，扩增产物已不再呈指数级增加，PCR终产物量与起始模板量之间没有线性关系，无法计算起始模板拷贝数。因此只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，故选择在这个阶段进行定量分析。为了定量方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了几个重要的概念：扩增曲线、荧光阈值、CT值。