新型亲和法外泌体提取试剂盒

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS

　　MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS采用磷酯酰丝氨酸（PS）亲和Tim4蛋白固化磁珠（PS亲和法）的方法可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高纯度的外泌体，请使用10,000×g离心后的上清。

　　该试剂盒使用含有EDTA的中性洗脱缓冲液将外泌体完整洗脱下来，所提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验，包括电镜分析（TEM）、纳米粒子追踪（NTA）分析、投喂实验、分子组成（蛋白质、脂质、核酸等）分析等。

◆膜表面磷酯酰丝氨酸（PS）亲和法

　　Tim4蛋白固化磁珠，在金属离子存在的条件下亲和细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸（PS），然后使用含有EDTA的洗脱液进行洗脱，捕获高纯度的完整细胞外囊泡

◆优点・特色

使用新型亲和提取方法

无需进行超离

●　使用磁珠改进了操作

●　流程优化

※　高重复性

样品类型：细胞培养上清、血清、血浆、尿液等。

●　可以纯化高纯度和完整的细胞外囊泡

●　可以从细胞上清液、血清、血浆和尿液中纯化外囊泡

●　重复性高，回收量稳定

●　简易操作（约3.5小时）

●　启用多个样品（无需超速离心）

◆产品列表

 *每套试剂盒能完成5次回收实验，即实际使用量为10×5次/Kit与2×5次/Kit

◆案例•应用

从血清、血浆、尿液中提取的细胞外囊泡的分析

从人血清中提取外泌体的产量比较

　　使用该试剂盒，超离法和抗体亲和法提取人血清的外泌体，接着用CD9和CD63抗体进行免疫印迹实验。

●　检测抗体

      抗CD9兔多抗，System Bioscience公司

      抗CD63兔多抗，System Bioscience公司

●　免疫印迹（WB）数据

      各样品结果相当于150 μL的血清样本。从100 μL提取物中取出15 μL，添加5 μL的4×SDS样品缓冲液，全部上样。

从人EDTA血浆中提取外泌体

　　分别从1 mL的EDTA血浆、EDTA血浆（超滤更换缓冲液）、人血清中提取外泌体，进行WB检测（抗Flotillin2抗体）。

●　检测抗体

      抗Flotillin-2小鼠单抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience公司

●　使用样品量

      各1 mL

●　免疫印迹（WB）数据

      各样品结果分别对应150 μL样品量。从100 μL提取物中取出15 μL，添加5 μL的 4×SDS样品缓冲液，全部上样。

从人尿液中提取外泌体的回收量比较

　　1 mL人尿液分别通过本试剂盒、聚合物沉淀法、超离法进行外泌体回收，并做免疫印迹（WB）检测（抗CD9抗体）。

●　检测抗体

      抗CD9兔多抗，System Biosciences公司

●　使用样品量

      各1 mL

●　免疫印迹（WB）数据

      各样品结果分别对应150 μL尿液样品。从100 μL提取物中取出15 μL，加入5 μL的 4×SDS样品缓冲液，全部上样。

◆与传统沉淀法的功能比较实验

　　分别用本试剂盒、超离心法和聚合物沉淀法从K562（人慢性骨髓性白血病）细胞培养上清（无血清培养上清或10%Exosome-depleted FBS添加培养基）提取外泌体，分别比较三种方法的外泌体回收量和外泌体纯度。

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS【PS亲和法】

　　按照试剂盒的操作说明（反应时间：3小时），从1 mL经过离心处理（10,000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）中提取外泌体。

超速离心法

　　将10 mL经过离心处理（10,000×g，30 min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）进行超离（110,000×g，70 min），用TBS缓冲液重悬沉淀物后，再进行超离（110,000×g，70 min），回收沉淀部分。

聚合物沉淀法

　　从1 mL经过离心处理（10,000×g，30 min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）中，按照市售的A公司产品的操作说明（静置时间：过夜）提取外泌体。

※1：110,000×g离心2小时，在不吸到沉淀的前提下回收上清。

比较提取的外泌体的透射电子显微镜（TEM）分析结果和纳米粒子追踪（NTA）分析结果

　　分别用本试剂盒、超离法、聚合物沉淀法提取外泌体，用NanoSight LM10检测外泌体片段的粒子直径。另外，用终浓度为2%的多聚甲醛固定提取到的外泌体片段（2~4×10¹⁰ particles），在透射电子显微镜进行分析。

电子显微镜图像 数据提供：金泽大学 医学系 华山教授、大阪大学 iFReC 中井先生

MagCapture™ 可提取到很多100 nm左右的粒子，在透射电子显微镜中也可以确认到很多细胞外囊泡。

K562细胞培养上清提取的外泌体回收量和纯度的比较（无血清培养基）

　　用PS亲和法、超离法和聚合物沉淀法从K562 细胞培养上清（无血清培养基）获得样品进行电泳。接着用银染色和WB法（CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗体）进行实验。

回收量，不是回收率

●　检测抗体

     抗CD63小鼠单抗（MEM-259）

     抗Flotillin-2 小鼠单抗  （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠单抗 （25/Lamp-1），BD Bioscience公司

K562细胞培养上清提取外泌体的回收量和纯度的比较（10%FBS-添加培养基）

　　用MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 、超离法和聚合物沉淀法，从K562 细胞培养上清（10% 去外泌体 FBS补充培养基）获得样品进行电泳，用银染法和WB法（CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗体）进行实验。同时，对外泌体提取片段进行质谱测定，比较所有测定的多肽中来自K562细胞的人来源多肽的比例（由于添加到细胞培养基的FBS中牛蛋白聚集体是混杂的，所以人来源多肽的比率会下降）。

●　检测抗体

     抗CD63小鼠单抗（MEM-259）

     抗Flotillin-2小鼠单抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠单抗（25/Lamp-1），BD Bioscience公司

     健康人血清来源的外泌体中提取miRNA和mRNA的回收量比较

实验数据

①运用不同方法提取外泌体并比较从中提取的microRNA和mRNA的回收量

通过超离法和PS亲和法将EVs从正常人血清中分离，然后使用microRNA提取试剂盒（产品编号295-71701）提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA，并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

相比超离法，PS亲和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高产量。

②运用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比较

　　运用PS亲和法将EVs从正常人血清中分离，然后使用microRNA提取试剂盒（产品编号295-71701）或基于AGPC法的试剂提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA，并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

对比AGPC法，使用microRNA提取试剂盒更能有效提取PS亲和法纯化所得EVs中的microRNA和mRNA

◆外泌体蛋白质组学分析

<实验内容及结果>

　　分别利用PS亲和法、超离法、聚合物沉淀法，从含10% FBS（不含外泌体）的K562细胞培养上清液中提取外泌体。将提取样品用10%聚丙烯酰胺电泳分离，剪切出全部的蛋白质条带。然后在凝胶内进行消化，用LC-MS对蛋白质进行检测。对上述三种方法提取的外泌体进行蛋白质组合的相关性比较。

比较通过MASS分析鉴定的*个蛋白质

白色柱：源自外囊泡的人类蛋白质

灰色柱：来自FBS的牛蛋白污染物

红 色：来自外囊泡的标记蛋白

样品：K562细胞培养基（含有10%去除外泌体胎牛血清）

成对组合相关性比较

◆应用数据

Protein Assay BCA Kit检测外泌体的蛋白质浓度

　　Protein Assay BCA Kit是利用二辛可宁酸（BCA）定量检测溶液中的蛋白质浓度的试剂盒，是蛋白质定量检测法中通用的方法。其原理为，碱性条件下的蛋白质Cu²⁺ 离子被还原为Cu⁺。Cu⁺与BCA形成络合物，即产生紫色螯合物，蛋白质浓度与紫色螯合物颜色深浅有关，通过测定562 nm处的吸光度，并与标准曲线做比照，即可定量溶液中的蛋白质浓度。

利用MagCapture™外泌体提取试剂盒从细胞培养上清液中提取外泌体，通过Protein Assay BCA Kit高灵敏的检测外泌体中蛋白质浓度。

【实验内容及结果】

　　将通过MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的25 μL外泌体溶液分注于96孔板中，加入 Protein Assay BCA Kit中试剂A和试剂B混合液200 μL。之后60℃孵育30分钟，检测560 nm吸光度（图1）。结果表明，通过Protein Assay BCA Kit的高灵敏度检测，可测定提取后外泌体中蛋白质浓度。

图1. Protein Assay BCA Kit 检测BSA的检量线和提取的外泌体蛋白质浓度的检测

<BCA Assay 操作概要>

由于外泌体蛋白质浓度相当低，因此BCA测定时不要稀释样品。

①　将BSA标准溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625 μg／mL和空白对照，分别每孔25 μL加到96孔板中。

②    分别把提取的外泌体和洗脱缓冲液（空白）按照每孔25 μL加入96孔板。

③    把200μL Protein Assay BCA Kit（产品编号：297-73101）的试剂A盒试剂B混合液（A:B=50:1）加入放有

③    样品的孔板中。

④    60℃孵育30分钟

⑤    室温条件下降低孔板温度

⑥    测定560 nm的吸光度

◆外泌体的标记和Hela细胞导入实验

【实验概要】

用PKH67（Sigma公司）标记MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的细胞外囊泡， Hela细胞导入确认

<外泌体PKH67标记>

1. MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取外泌体（实验当天从K562细胞培养上清液提取外泌体）

2. 用BCA Assay和NanoSight检测样品的蛋白质浓度和粒子浓度

3. 将相当于5 μg*蛋白量的外泌体样品溶液分装至1.5 mL管中。

*请配制合适的使用量

4. 将2.0 μL的PKH linker溶解在0.25 mL的DiluentC中。…4×Dye solution*

*请配制合适的使用量

5. 添加1/3样品量的4×Dye solution至样品中，混合后在室温中孵育5-10分钟。

6. 根据附带的操作说明用PBS平衡Exosome Spin Columns （MW 3000）（Thermo公司）。

7. 将100 μL样品分别加入上述平衡后的旋转柱*中，离心（大添加量：100 μL）。

*准备必需的支数。

8. 将外泌体溶液*加入到已经接种好Hela细胞的培养皿中，24小时后用显微镜观察并利用流式细胞仪进行分析。

*根据实验调节外泌体添加量

图1. PKH标记外泌体的细胞捕获观察

从16 mL K562培养上清液中超滤浓缩得到4 mL培养上清液作为样品，通过PS亲和法提取外泌体。

●　提取的外泌体蛋白质浓度：22.3 ng/μL

●　粒子浓度：1.2×10⁸ particles/mL

将上述标记的外泌体溶液全部加入接种好的Hela细胞中，24小时后用荧光显微镜（左）和流式细胞仪（右）检测捕获情况。

Opti-MEM：取相同量用PKH标记后添加到细胞中作为阴性对照。

◆细胞培养上清•血清•血浆的预处理操作

　　样品预处理：对样品进行1,200×g离心操作※1。如果要得到更高纯度的外泌体，则按照下述步骤对样品进行10,000×g离心操作※2。

　　下文是细胞培养上清、血清/血浆的预处理方法。其他体液样品的预处理操作，请参考血清/血浆的实验步骤，做适当调整。

更换缓冲液（限制过滤）操作

用50 mL TBS 缓冲液对1 mL 已经经过离心处理的EDTA 血浆样品进行缓冲液更换。

1. 把19 mL TBS 加进VivaSpin20（100K）中。

2. 把1 mL 离心过的EDTA 血浆上清添加在第1. 的VivaSpin20（100K）中，

　混匀。

3. 把第2. 的VivaSpin20（100K）在4℃下进行离心处理。

4. 减少上线的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 缓冲液。

5. 4℃下离心处理。

6. 减少上面的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 缓冲液。

7. 4℃下离心处理。

8. 减少上面的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加11 mL TBS 缓冲液。

9. 4℃下离心处理直至样品液量达到1 mL 以下。

10. 进行提取。

◆MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 操作步骤

◆产品列表