NanoView公司所开发的全自动外泌体荧光检测分析系统是一款无需纯化的、全自动的可对单个外泌体进行表征分析的全新设备。该设备能够提供全面的外泌体表征信息，包括外泌体粒径大小、计数、分布、携带蛋白表达、生物标志物（CD9，CD81，CD63等）共定位等。操作简单，结果可靠。一经推出，便引起了外泌体领域科研工作者的广泛关注，短短两年时间在全球已有50多个实验室采用该技术，发表重要文献近百篇。

全自动外泌体荧光检测分析系统基本原理是一种基于特异性免疫捕获技术，允许研究者直接分析特定群体的外泌体或外囊泡。通过配套的试剂盒，客户一次性能够分析多达9个不同的样本，大大节省了时间和经济成本。兼容各种生物样本，除了纯化的外泌体之外，对于血液、尿液、恶性肿瘤、腹水中的外泌体也可直接检测分析，大大拓展了研究范围

应用方向及主要特征

生物标记物共定位 最多可量化4种标记物的表达情况	计数分析 直接从样品中计算抗原阳性外泌体的数量，无需提纯
粒径分析 高精度统计外泌体的颗粒大小及分布	检测外泌体内容物 使用ExoView Cargo试剂盒可探测外泌体内部核酸的装载情况，分析装载率
荧光检测 具备3个荧光通道，能够探测单个蛋白的结合	线性工作流程 最高9个样品的全自动分析
无须纯化 无需担心纯化带来的误差，更精确的测量样品间的表征和表达信息的差异	多重样本分析 最多可使用6种表面标记物来筛选外泌体

外泌体粒径分析

能够对>50 nm的外泌体进行全方面的表征，无论是粒径尺寸、粒径分布还是外泌体的亚型均可在一次测试中得到。并且所用来测试的样本无需进行纯化，避免因纯化带来的样本偏差。

分析不同大小和不同尺度的外泌体亚群，在CD171过表达系统中，100 nm以上的外泌体仅表达了CD171。

量化外泌体亚群

通过抗体捕获的模式，能够量化含有不同标记物的外泌体亚群，并对不同种群的外泌体进行特异性计数和分析。整个过程无需纯化，并且线性范围可跨越3个数量级。

TSPAN8阳性细胞外囊泡的稀释曲线。使用1:3比例的梯度稀释。用R2 = 0.9986计算与TSPAN8荧光数据的线性拟合。

检测外囊泡中的装载物

MISEV建议在表征外泌体和外囊泡时，应当同时测量表面和载体蛋白。使用ExoView芯片可穿透外泌体，探测膜内蛋白和载体。并且单次可定量3种表面、管腔蛋白。

检测细胞外泌体内的Syntenin。

WT细胞在未穿膜的条件下几乎观测不到Syntenin的信号。进行穿膜处理后可以观测到Syntenin信号，而KO之后信号消失

生物标志物共定位

能够在单个外泌体样本上检测多达4种标记物，并同时提供外泌体的其它表征数据诸如计数、颗粒尺寸统计等。

无需纯化

只测量含有靶标抗原的特定细胞外泌体群体。仅需35 μL的稀释样品，即可直接获得外泌体的表型、粒径和计数信息。并且无需担心污染物对测试的影响。

无论纯化与否，Exoview均可进行分析

ExoView™ Kit 配置清单:

应用案例：

对不同体液中小RNA测序以筛选最佳的胞外RNA提取方法

exRNA profile会受到不同来源（细胞/组织），不同状态（年龄/健康程度/器官状态）的影响，且由包括外泌体在内的不同的载体运输，加上不同的提取方法和检测技术，均会影响exRNA profile的测定结果。现今的小RNA测序方法已经可以准确地表征exRNA profile，因此合适的exRNA提取方法便至关重要。Srinivasan[1]等通过使用多种exRNA分离方法分离不同位点获得的5种体液中的外泌体，分析结果后总结出了不同体液的适合分离方法。

其中，研究人员使用单个外泌体表型分析技术(Exoview)检测了来源于人血浆的外泌体的蛋白marker表达，判断出血浆外泌体根据蛋白marker主要分为CD63-/CD81+/CD9+和CD63+/CD81+/CD9+两种。

人血浆外泌体蛋白表达分析

参考文献：[1] Srinivasan, S., Yeri, A., Cheah, P. S., Chung, A., Danielson, K., De Hoff, P., ... & Laurent, L. C. (2019). Small RNA sequencing across diverse biofluids identifies optimal methods for exRNA isolation. Cell, 177(2), 446-462.

Brain Behavior and Immunity：脊髓损伤导致血清神经炎症相关纳米颗粒中miRNA与CD81+外泌体水平的改变

脊髓损伤（SCI）会对机体产生系统性影响，导致呼吸、免疫、消化等功能异常，以及相关脑区产生神经炎症和退行性病变。有研究表明，SCI的病理与系统性影响可能与血液来源的因子如外泌体的运输有关；而在中枢神经系统损伤模型中，外泌体可能参与了miRNA等炎性因子运输导致炎症扩散。Khan等[1]使用包括Exoview外泌体表型分析的多种技术详细表征了SCI建模的小鼠血浆外泌体，发现损伤后外泌体数量、蛋白marker和内容物均有明显的变化，将SCI小鼠的外泌体注射入脑室还可诱发产生炎症。

研究人员使用ExoView检测了SCI血浆外泌体的粒径、数量、荧光强度和共定位（图1A）。外泌体在CD81和CD9区域产生特异性结合而被捕获，而没有CD63捕获。根据干涉成像获得外泌体尺寸分布，其中在50nm最多（图1B&C）。荧光成像则检测到了大量干涉成像检测不出的尺寸小于50nm的外泌体（图1D&E），CD81和CD9在大量外泌体上表型出荧光共定位，而CD63荧光则未被检测到，这与图1C结果一致（图1F-H）。相比之下，NTA与流式分析无法检测到尺寸小于50nm的外泌体。

图1 ExoView检测血浆外泌体的粒径、数量、荧光强度和共定位

研究人员进一步比较了SCI组和对照组的血浆外泌体变化，结果表明，在损伤后1d的时间点，CD81外泌体数量相对对照组更高，与Western Blot的结果一致；而CD9外泌体数量则没有统计学差异，与流式分析的结果一致（图2A&B）。基于图2H的CD81与CD9有大量的荧光共定位，检测CD9外泌体的CD81荧光强度，由1d的荧光强度中位数差异可知，

图2 ExoView检测血浆外泌体的粒径、数量、荧光强度和共定位

参考文献：[1] Khan, N. Z., Cao, T., He, J., Ritzel, R. M., Li, Y., Henry, R. J., ... & Wu, J. (2020). Spinal cord injury alters microRNA and CD81+ exosome levels in plasma extracellular nanoparticles with neuroinflammatory potential. Brain, behavior, and immunity.

Cells：CD44糖蛋白在胃癌发生中的作用

CD44是一种跨膜糖蛋白，能够介导细胞间与细胞-基质间相互作用，主要配体为透明质酸（HA）。研究表明，CD44与肿瘤的生长相关，其在肿瘤细胞中高表达，且CD44与HA的结合亲和力高，因此纳米载体常用HA做表面修饰以作为肿瘤细胞的靶向药物载体。外泌体是天然的靶向信息传递载体，有研究在外泌体中检测到CD44。Härkönen等[1]使用胃癌细胞MKN74研究了CD44表达对外泌体分泌，HA合成与肿瘤细胞生长的影响。结果表明，CD44促进了细胞表面和细胞间的HA形成，调控肿瘤微环境；CD44可改变外泌体的物理性质以及靶向性质。

其中，研究人员使用Exoview检测了MKN74细胞的未经纯化的培养基及分离纯化后的外泌体中的含CD44以及其他标记物的含量。结果表明，相对于对照组，MOCK（CD44敲除）细胞组在未经纯化的培养基及分离纯化后的分泌外泌体的数量显著降低。以上结果表示ExoView可以直接对复杂环境的培养基进行检测，无需分离纯化步骤，且检测结果具有*特异性。

ExoView检测表达不同蛋白标记物的外泌体数量

参考文献：[1] Härkönen, K., Oikari, S., Kyykallio, H., Capra, J., Hakkola, S., Ketola, K., ... & Rilla, K. (2019). CD44s assembles hyaluronan coat on filopodia and extracellular vesicles and induces tumorigenicity of MKN74 gastric carcinoma cells. Cells, 8(3), 276.

Cancer Cell Int：外泌体与miRNA调节成神经管细胞瘤的干细胞性

脑瘤中部分细胞具有干细胞特性，能够自我更新并分化为不同细胞系。其中，成神经管细胞瘤的病人有25%经过传统疗法后5年内复发并转移导致死亡，存活的病人也受到治疗副作用和并发症影响，因此需要一种安全有效的治疗方法。肿瘤细胞的外泌体含有miRNA，能够调节细胞增殖、分化、代谢、凋亡等生理过程并与抗药性相关。有研究表明肿瘤干细胞的外泌体运载了肿瘤细胞*的miRNA，能够产生有利于肿瘤发展的微环境。Choi等[1]研究了成神经管细胞瘤的外泌体及运载的miRNA及其在肿瘤康复中的潜在作用。其中，miR-135b和miR-135a在肿瘤干细胞中高表达，抑制两者会导致具有肿瘤抑制作用的Angiomotin‑like 2（AMOTL2）表达上升，使肿瘤干细胞的干细胞特性下降。

其中，研究人员使用ExoView通过荧光成像检测肿瘤细胞与肿瘤干细胞的外泌体标记物，在两种细胞的外泌体上均检测到了Alix和Syntenin两种内蛋白，并且可以确定两种内蛋白与CD63/CD9外泌体标记物共定位。

Exoview检测外泌体上的Alix（a）与Syntenin（b）蛋白

参考文献：[1] Choi, S. A., Koh, E. J., Kim, R. N., Byun, J. W., Phi, J. H., Yang, J., ... & Kim, S. K. (2020). Extracellular vesicle-associated miR-135b and-135a regulate stemness in Group 4 medulloblastoma cells by targeting angiomotin-like 2. Cancer cell international, 20(1), 1-14.

ExoView外泌体全面表征试剂盒