水果中相当部分的干物质是有机酸,它往往比许多其他物质更多地决定水果的特殊味道,并在食品营养学中占有重要位置，有机酸除了具有抗生素作用外，还具有其它几种作用，包括降低消化物pH和增加胰腺分泌。不同种类的水果中有机酸的种类和含量差别很大,故在现代食品工业中对有机酸的研究已愈加重视和普及。液相色谱法操作简便、准确度高、重现性好,可同时定量测定多种有机酸,但液相色谱法测定水果中有机酸的报道中有机酸种类及水果品种相差较多，尤其是草莓与油桃这两类水果未见报道。

考虑到***体成分复杂,从保护色谱柱及提高分离效果的目的出发,本文将卡瑞(Carrez)试剂作为水果样品净化剂应用于水果中有机酸的测定.

1实验部分

1.1仪器与试剂

Agilent1100液相色谱仪(含四元泵、柱温箱、可变波长紫外检测器、手动进样器、定量环等).水相针式过滤头,去离子水(电阻率可达18MΩ·cm).草酸、酒石酸、维生素C(抗坏血酸)、L2苹果酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸(丁二酸)等有机酸对照品均为分析纯试剂.甲醇为色谱纯试剂,磷酸二氢钠及磷酸为分析纯试剂.流动相经0.45μm滤膜过滤.样品为市售新鲜水晶梨、砀山梨、苹果梨、新疆香梨、新疆贡梨、富士苹果、草莓、油桃等

1.2对照品及供试品溶液的制备

对照品溶液的制备:分别称取适量各有机酸对照品(0.5～1.5g,至0.1mg),分别用流动相缓冲溶液溶解并定容于100mL容量瓶中,作为有机酸的标准贮备液.使用时各取1.00mL配制成有机酸的混合标准液,再将混合标准液在25mL容量瓶中用流动相缓冲溶液稀释成不同的浓度梯度,即上述溶液浓度的0.2,0.4,0.6,0.8,1.0倍。

供试品溶液的制备:榨汁法制样(选果2削皮2切片2榨汁2过滤),所得果汁准确称取3g左右,加入适量流动相缓冲溶液后,加入Carrez试剂I和II各0.1mL,再用流动相缓冲溶液定容于25mL容量瓶中,静置

1.3色谱条件

色谱柱:EclipseXDB2C8柱(4.6×150mm,5μm);流动相A:甲醇,流动相B:0.01mol·L-1磷酸二氢钠2磷酸缓冲液(pH=2.6);梯度洗脱程序:0～2.4min内,由7.5%A变化为1.5%A,此后流动相A的比例不变.流动相流速:0.5mL·min-1;进样体积:20μL;紫外检测波长:214nm;柱温:25°

2结果与讨论

2.1色谱条件的优化

2.1.1检测波长的确定

对每种有机酸的吸光度进行波长扫描,发现这8种有机酸的zui大吸收波长在204～243nm之间.并经实验确定214nm为检测波长。

2.1.2流动相的选择及其pH值的确定

甲醇2水系统或甲醇2磷酸盐缓冲系统是在C8或C18柱中应用zui广的流动相,经实验发现用甲醇2磷酸盐缓冲系统更适合使用C8柱分析有机酸.由于流动相的pH值对有机酸的保留时间有较大影响,因此,通过调节流动相的pH值(pH2.3,2.5,2.6,2.7,2.8)对8种有机酸进行检测,当pH值较小时草酸与酒石酸分离效果很好,但富马酸和琥珀酸分离效果不佳;当pH值较大时结果相反.pH值为2.6时分离效果较好.

2.1.3流动相流速

实验分别考察了0.2,0.5,0.8,1.0mL·min-14个条件.流速为0.5mL·min-1时,色谱分离效果.

2.1.4流动相的配比

分别考察了等度洗脱(甲醇含量分别为1%,2%,3%,5%,6%)及梯度洗脱两种情况.发现在等度洗脱中,当甲醇比例较大时草酸与酒石酸分离较好,但柠檬酸与乳酸、富马酸和琥珀酸分离效果不佳;当甲醇比例较小时分离情况相反.且每种甲醇比例均不能使维生素C与L2苹果酸得到有效分离,说明等度洗脱不能满足分离要求.根据上述经验,经多次实验尝试了各种梯度后,发现当梯度为0～2.4min内,流动相中甲醇的比例由7.5%变化为1.5%,此后流动相A的比例不变时,维生素C与L2苹果酸分离较好并能够进行定量分析,其他有机酸也能达到分离的目的。

2.2线性关系、检出限、精密度及回收率

将混合标准有机酸的系列工作溶液,按上述色谱条件依次由低浓度向高浓度经0.45μm针头过滤后进样20μL,采集数据.分别以各组分的峰面积y对标准工作溶液的浓度x(mg·mL-1)进行线性回归分析,8种有机酸的回归方程、相关系数及检出限见表1。

准确称取相同样品(水晶梨)两份,其中1份加入已知量有机酸标样,另一份不加,每份样品平行测定3次,利用增量法计算回收率,并计算变异系数。

由表1可知,有机酸回归方程的相关系数大于0.9995,线性良好.本法的回收率在93.01%～101.79%之间,变异系数在4%以内,精密度较高,结果准确。

2.3样品制备方法的探讨

2.3.1关于榨汁制样法与水果中维生素C含量的测定

采用榨汁法测定水果中有机酸,未能检测出水果中的维生C,故怀疑在样品制备过程中,维生素C被破坏而未能检测到.本实验也采用榨汁法制样并检测到了维生素C,且效果良好.比较本实验，发现制样过程中有明显不同的一点就是本实验采用流动相酸性缓冲液定容,选用纯水定容.这是由于液体维生素C具有较强的还原性,易受空气、热、光等因素影响,但在酸性溶液中较稳定.故采用榨汁法制样,用流动相酸性缓冲液定容,从而实现了维生素C的检测。

2.3.2样品制备中加入Carrez试剂

液相色谱法对样品的处理要求较高,一方面要求样品成分尽量简单以消除基体对测定对象的干扰,另一方面对色谱柱的容量、使用寿命等保护色谱柱的角度要求进柱之前的样品尽量简单.而水果原汁样品往往成分复杂,基体干扰大,对色谱柱负担重.本实验从保护色谱柱及提高分离效果的目的出发,尝试向水果样品中加入Carrez试剂,使蛋白质、脂肪等杂质沉淀。

在含果汁3g左右,欲25mL定容的样品中加Carrez试剂I和II各0.1mL与不加Carrez试剂的原样进行检测对比,实验结果表明,加入Carrez试剂I和II各0.1mL,色谱峰数及保留时间基本不变,其有机酸含量也基本保持不变,即Carrez试剂的加入不影响水果有机酸含量的测定.如果增加Carrez试剂的加入量(如加入0.25mL),则对样品中有机酸的测量产生一定影响,使测量值普遍偏低(富马酸除外)。

加入Carrez试剂的另一特点就是可以提高有机酸分析的精密度和回收率,实验结果见表2.加入Car2rez试剂处理样品后每种有机酸的测定精密度均有不同程度的提高,乳酸、柠檬酸、富马酸的回收率也比不加Carrez试剂时有了明显好转。

2.4不同水果有机酸含量的分析结果

2.4.1不同梨品种中有机酸含量

按2.1和2.3中所述的*色谱检测条件和制样方法,分别测定水晶梨、砀山梨、苹果梨、新疆香梨、新疆贡梨中的有机酸.不同品种梨中有机酸含量见表3。

由表3可知,不同品种梨中各种有机酸所占的比例基本相同.砀山梨草酸含量低(0.228),维生素C含量较高(0.546).水晶梨虽然草酸含量略高(0.307),但维生素C(0.450)、苹果酸(1.651)、柠檬酸(1.027)含量较高.苹果梨中苹果酸(1.807)与柠檬酸(1.107)含量高,但相应的维生素C含量较低(0.323),且草酸含量略高(0.391)。

2.4.2不同水果中有机酸含量

按2.1和2.3中所述的*检测条件和制样方法,分别测定草莓、水晶梨、富士苹果、油桃水果中有机酸含量见表4。

由表4可知,草莓(0.592)和梨(0.450)中维生素C含量较高,苹果(2.482)和油桃(3.400)中苹果酸含量较高.油桃中有机酸种类zui为丰富,营养全面,且草酸含量低(0.242).梨中维生素C含量高(0.450),草酸含量低(0.307),相对营养价值zui高.草莓维生素C(0.592)及柠檬酸(7.505)含量*,但草酸含量也zui高(1.137),可作为提取维生素C及柠檬酸的原料。

实验建立了一种液相色谱测定水果中有机酸类物质的方法.使用C8柱,甲醇2磷酸盐缓冲溶液为流动相,梯度洗脱,在6min内较好地分离和定量分析了草莓、梨、苹果及油桃等水果中8种有机酸的含量.使用Carrez试剂作为水果样品净化剂,不仅可达到净化样品、保护色谱柱的目的,同时可以适当提高样品检测的精密度和回收率.该方法不仅准确、可靠、重复性好,而且分析效率高.为定量分析能够榨成汁的水果中有机酸类物质的含量提供了参考,对水果食品加工及保鲜有一定的实际意义.用该方法分析了不同品种梨中各有机酸的含量,结果显示不同品种梨中各种有机酸所占的比例基本相同.几种水果中油桃含有机酸种类zui为丰富,草莓中维生素C及柠檬酸含量*。