二手测序仪注意事项

    1．abi prism 310基因分析仪是精密仪器，需专人操作、管理和维护。

    2．本实验测序pcr反应的总体积是5μl，而且未加矿物油覆盖，所以pcr管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧pcr管盖外，选用pe公司的pcr管。如pcr结束后pcr液小于4～4.5μl，则此pcr反应可能失败，不必进行纯化和上样。

    3．作为测序用户来说，只需提供纯化好的dna样品和引物，一个测序pcr反应使用的模板不同，需要的dna量也就不同，pcr测序所需模板的量较少，一般pcr产物需30～90ng，单链dna需50～100ng，双链dna需200～500ng，dna的纯度一般是a260nm/a280nm为 1.6～2.0，用去离子水或三蒸水溶解dna，不用te缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。

    4．本实验使用的测序试剂盒是bigdye荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测dna长度为650bp左右。本仪器dna测序度为 (98.5±0.5) %，仪器不能辨读的碱基n<2%，所需测定的长度超过了650bp，则需设计另外的引物。二手测序仪为保证测序更为准确，可设计反向引物对同一模板进行测序，相互印证。对于n碱基可进行人工核对，有时可以辨读出来。为提高测序的度，根据星号提示位置，可人工分析该处彩色图谱，对该处碱基作进一步核对。