产品介绍：

　DNA无缝克隆技术是一项简单、高效、快速将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点的方法，本产品不依赖于T4连接酶，不受载体和目的片段酶切位点的限制，而直接使用同源重组的方法，采用特殊的酶将任意方法线性化后的载体与线性化载体两端具有20-25 bp重叠区域的PCR片段定向重组，50℃反应5-15分钟即可快速实现1-5个片段的定向无缝克隆。

产品名称：康为世纪 快速DNA无缝克隆预混液

产品货号：CW3034S

产品相关原理：

产品特点：

1.15分钟可以将一个或者多个长、短PCR扩增片段（平/A端） 插入载体。

2.不受载体和插入片段酶切位点的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位点进行克隆。

3.无缝克隆，插入点不会引入不需要的碱基序列。

4.高效、准确，克隆阳性率＞95% 。

产品组分：

额外试剂需求：

1.插入片段，特异引物，线性化载体

2.高保真PCR试剂（推荐使用康为CW2965 Super Pfx MasterMix）

3.感受态细胞

4.胶回收试剂盒（CW2302 快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒）

5.PCR仪，PCR反应管等。

使用前准备:

线性化载体的制备回收

选择合适的克隆位点对载体进行线性化，载体线性化方式有两种：限制性内切酶酶切消化，反向PCR扩增。

a.酶切所得线性载体，单酶切或者双酶切均可，酶切后推荐用PCR产物纯化试剂盒或者胶回收试剂盒纯化载体。因无缝克隆产品体系中没有DNA连接酶，所以不会引起载体自连，重组产物转化后出现的假阳性克隆 (无插入片段) 是由酶切不*未线性化环状载体转化而形成的，所以我们推荐酶切后胶回收纯化，可以将未线性化载体比例降低到低程度。

b.反向PCR扩增得到线性化载体，推荐使用高保真聚合酶扩增，以减少扩增突变

的引入，使用环状质粒为模板时，建议使用内切酶Dpn I对PCR产物进行消化，以减少环状质粒模板残留引起的克隆假阳性。如果使用Dpn I消化质粒模板，需80℃加热20分钟失活Dpn I活性，以避免重组反应时残留Dpn I对克隆载体的降解。

相关使用说明：

1. 线性化载体与插入片段的使用量

载体一般用20-50 ng，插入片段与载体的摩尔比在2:1-3:1之间最佳；多片段连接的情况下，片段与片段之间摩尔比为1:1。

单片段克隆用量

最适克隆载体使用量=（0.02 x 克隆载体碱基对数）ng（0.03 pmol）

最适插入片段使用量=（0.04 x 插入片段碱基对数）ng（0.06 pmol）

多片段克隆用量（2-5个片段）

最适克隆载体使用量=（0.02 x 克隆载体碱基对数）ng（0.03 pmol）

每个插入片段的使用量=（0.02 x 每个插入片段碱基对数）ng（0.03 pmol）

轻轻混匀，在50℃水浴或者PCR仪中反应5-15分钟，超过3个片段的连接，可以延长反应时间至30分钟。反应结束后，将EP管置于冰上降温后直接转化或者保存于-20℃。

保存条件：-20℃，保质期一年。

产品订购信息：

品牌             货号                   名称                                      规格

康为世纪  CW3034S  One Step Seamless Cloning Mix   20 rxns

产品名称：康为世纪 快速DNA无缝克隆预混液

产品货号：CW3034S

关于公司：

康为世纪是主要从事高附加值、高技术含量的生物试剂的研发与生产，为生命科学研究、基因检测和体外诊断用户提供创新型生物产品和服务。康为世纪建立了专业化、集约化、能够形成自主知识产权的技术创新体系和开放式的合作创新平台，构建成了公司完整的研发创新体系。

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红荣微再作为RNA、NGS、ctDNA、qPCR的分子诊断专业供应商，以“传递科学价值，服务科学研究"为宗旨,努力为客户提供质量可靠、货美价优的分子诊断试剂耗材，与客户携手为中国分子诊断的发展而前行。