使用方法

1) 取出印记膜，加入合适的封闭液在温室下孵育20-60分钟，同时振荡，以封闭膜上非特异性蛋白结合位点。

2) 将膜从封闭液中取出，与一抗工作液在温室孵育1小时，同时振荡；或在28℃孵育过夜，不振荡。

3) 将足量的洗涤缓冲液加至膜上，保证缓冲液将膜*覆盖。振荡孵育≥5分钟，更换洗涤缓冲液并重复该步骤4-6次。增加洗涤缓冲液体积，洗涤次数和洗涤时间有助于降低背景信号。

注：1）孵育前，膜在洗涤缓冲液中的短暂淋洗会提高洗涤效率；2）按前文建议的HRP标记二抗稀释度非常重要的。

4) 将HRP标记的二抗工作液与膜在温室孵育1小时，同时振荡。

5) 重复步骤3，以除去未结合的HRP标记二抗。注：膜与HRP标记二抗孵育后必须进行*洗涤。

6) 将A溶液与B液等比例混合，制备成工作液。每cm2膜使用0.01～0.1ml工作液，工作液可以在温室下稳定8小时。

7) 将印记膜在工作液中孵育5分钟。从工作液中取出印记膜，并置于一个塑料片或清洁的塑料纸（膜）中，用一张吸水纸吸除多余的液体，并从印记和塑料纸之间小心地压出气泡。

8) 将包在塑料纸（膜）中的印记膜置于胶片暗盒中，蛋白质面朝上，除适用于胶片曝光的灯（如红色安全灯）之外，关闭所有的灯。

注;1）胶片必须在曝光期间保持干燥；2）确保将多余的底物从膜和塑料纸上*去除；3）在整个胶片处理期间，使用手套。

9) 将X光胶片置于膜的上面。建议次曝光60秒。之后可调整曝光时间以达到结果。化学发光反应在底物孵育后的前5-30分钟期间是强烈的。这一反应可以持续几个小时，但强度会随时间下降，如有底物孵育后较长时间后曝光，曝光时间可能需要延长以获得较强信号。如果使用磷光存储成像设备（如Bio-Rad的分子成像仪系统）或CCD照相机可能需要较长的曝光时间。

    注：胶片与膜之间的任何移动可能在胶片上造成人为的非特异信号。

10）使用合适的显影剂和定影剂对胶片进行显影。如果信号强，则缩短曝光时间或将印记膜进行剥离并降低抗体浓度重新检测。