蛋白质浓度测定是用于计算纯化方法的回收率的重要方法。常用的测定方法包括双缩脲法、Lowry法、紫外吸收法、BCA蛋白浓度检测法等。其中常用的方法就是BCA法。BCA 全称是Bicinchoninic Acid Assay， 也叫Smith Assay，这个方法是由Paul K. Smith 发明的。这个方法通过展示不同浓度样品的颜色变化来判断蛋白的浓度。

检测原理

BCA是一种碱性的水溶性复合物，性质稳定。在其提供的碱性环境下，蛋白质可以将BCA试剂中的Cu2+还原为Cu+，Cu+继而与BCA试剂螯合，从而产生蓝紫色的络合物，在562nm波长处具有强吸收峰，通过测定吸光度，结合标准曲线即可得知蛋白浓度。BCA法因抗干扰性强、简便准确，灵敏度高而得到广泛应用，但其也易受温度、孵育时间的影响。

实验步骤

一、配制标准品和工作液

1. 配制 BSA 标准品体系（线性范围 20-2000 μg/mL 或者 5-250μg /mL 标准品制备各 2 种配置方法，请根据习惯选用恰当方式）。【注】：BSA 标准品浓度为 2 mg/mL，稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋

白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用水或 1 X PBS 进行稀释。BSA 标准品体系配制表（配制后可放置于 4℃ 冰箱多次使用）

2. 配制 BCA 工作液

① 计算所需要的总 BCA 工作液体积。总 BCA 工作液体积=（标准品数量+待测样品数量）x 重复数 x 每个

样品所需要的 BCA 工作液。【注】：试管法检测时每个样品加 2.0 mL BCA 工作液，微孔板检测每个

样品加 200 μL BCA 工作液。

② 配制 BCA 工作液：50 体积的 BCA 试剂 A 中加入 1 体积的 BCA 试剂 B（A:B=50:1），充分混匀。【注】：BCA 工作液装入密封容器内，室温条件 24h 稳定。

二、检测方法

1. 试管检测方法（样品:BCA工作液=1:20）

2.微孔板检测方法（样品: BCA 工作液=1:20）

① 各取 10 μL 标准品和待测样品加入到微孔板中。【注】：样品与工作液比例为 1:20，检测范围为 125-2000μg/mL。若样品浓度非常低，可使用 25μL 标准品和待检测样品进行检测（即 1:8），这时试剂盒的检

测范围为 20-2000 μg/mL。

② 每孔加入 200 μL BCA 工作液，枪头吹打充分混匀。盖上微孔板，37℃ 孵育 30 min。

③ 冷却到室温，在酶标仪上的 562 nm 波长范围处检测吸光度。

④ 根据 BSA 标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的 OD 值即最终的读数），绘制标准曲线（ X-蛋白浓

度μg/mL；Y-最终的 OD 562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

注意事项

在进行BCA法检测蛋白浓度的实验过程中，精确性和可靠性是至关重要的。以下是一些关键的操作要点和在实验过程中可能遇到的常见问题及其解决策略：

▶ 试剂的准备和存储：确保所有试剂在使用前充分混合且在推荐的温度下存储。试剂的新鲜度对实验结果有显著影响，过期或不当存储的试剂可能导致不准确的结果。

▶ 操作顺序的严格遵守：在进行BCA实验时，严格按照试剂添加顺序和操作步骤进行，避免任何步骤的颠倒或省略。这些步骤设计的顺序是为了提高反应效率和结果的一致性。