高铁血红蛋白（MetHb）测试盒说明书

一、实验仪器：试管、微量移液器、旋涡混匀器、可见分光光度计（540、602和630nm）

二、适用范围：本试剂盒可测各种动物全血等样本中高铁血红蛋白含量；

三、测定意义：体内一氧化氮弥散入血后，很快与氧合血红蛋白结合形成高铁血红蛋白（methemoglobin, MetHb），NO与MetHb变化相关，故全血MetHb检测近年来受到的广泛重视。同时血液中高铁血红蛋白含量的测定对接触芳香族氨基、硝基化合物所引起的中毒性疾病的诊断与治疗，有重要的意义。

四、试剂组成及配制：

     A.试剂一：血红蛋白测定浓缩液，1ml X 2支,2—8℃保存。

               血红蛋白测定应用液的配制：临用前将浓缩液用双蒸水1:99稀释，即100倍稀释，现用现配。配好的试剂2—8℃避光保存，可存放一个月以上。

     B.试剂二: 高铁血红蛋白测定浓缩液，30ml X 1瓶，2—8℃。

              高铁血红蛋白测定应用液的配制：  浓缩液:双蒸水=1:9稀释，即10倍稀释，可存放6个月以上。

     C.试剂三：制作还原血红蛋白曲线用

              ① 白色粉剂 X 1支，2—8 ℃避光保存。

              ② 稀释液，1ml X 1支，2—8 ℃保存。

              试剂三应用液配制：临用前每支粉剂加入1ml稀释液，现用现配，注意避光。

     D.试剂四：制作高铁血红蛋白曲线用

              ① 砖红色粉剂 X 1支，2—8℃避光保存。

              ② 稀释液，1ml X 1支，2—8℃保存。

              试剂四应用液配制：临用前每支粉剂加入1ml稀释液，现用现配，注意避光

五、操作过程：

1、制备抗凝全血：取全血立即加入到肝素抗凝管内，加盖封口，轻轻颠倒混匀。

2、血红蛋白含量的测定：取 0.01ml 全血与 2.5ml 的 100 倍稀释的试剂一应用液（血红蛋白测定应用液），混匀，静置5分钟后，1cm光径，双蒸水调零，540nm处测定各管吸光度值。

3、高铁血红蛋白测定： 取0.05ml全血，加入2.5ml的试剂二稀释应用液（即高铁血红蛋白测定应用液），混匀，静置5分钟后，1cm光径，双蒸水调零，测定630nm处及602nm处吸光度值。如果没有双波长的分光光度计则可以先测定各管630nm处吸光度值，然后再测各管602 nm处吸光度值。但一定要注意各管的编号不要弄错。

六、计算公式：

①、血红蛋白含量的计算：血红蛋白克数/升=540nm处吸光度值×367.7

②、高铁血红蛋白百分比计算： MetHb% = (A630nm—r x A602nm)÷(A602nm x(R— r)) ×100%

③、高铁血红蛋白含量的计算：高铁血红蛋白克数 /升 = MetHb%×血红蛋白克数/升

【注1】 A630即在630nm波长时样本的吸光度值；A602即在602nm波长时样本的吸光度值

【注2】 R与r均为常数，R=1.81；r=0.14。（本研究所测定常数）

即计算公式可以简化为：

①、高铁血红蛋白百分比： MetHb% = (A630nm—0.14×A602nm) ÷(A602nm ×1.67) ×100%

②、高铁血红蛋白含量的计算：高铁血红蛋白克数/升 = MetHb%×血红蛋白克数 /升

七、计算举例：

①、取吸烟人全血，立即加入到肝素抗凝管，加盖封口，轻轻颠倒混匀。

②、取该全血0.01ml与2.5ml的100倍稀释的试剂一应用液（血红蛋白测定应用液），混匀，静置5分钟后，1cm光径，双蒸水调零，测定吸光度值为0.373，则通过公式可计算出血红蛋白含量。

    血红蛋白含量计算：血红蛋白克数/升=540nm处吸光度值x 367.7 =0.373 X367.7=137.15克/升

③、再取该全血0.05ml，加入2.5ml的试剂二稀释应用液(即高铁血红蛋白测定应用液），混匀，静置5分钟后，1cm光径，双蒸水调零，测得602nm处的吸光度值为0.226,测定管630nm处的吸光度值为0.066，通过公式可计算出高铁血红蛋白百分比：

高铁血红蛋白百分比计算：MetHb%=(A630nm- r×A602nm)÷(A602nm x(R- r)) ×100%

=(0.066-0.14x0.226)÷(0.226x1.67)x100%=9.10%

高铁血红蛋白含量的计算：高铁血红蛋白克数/升= MetHb%X血红蛋白克数/升

                                          =0.091x137.15克/升=12.486克/升

八、注意事项：

①、取血后应在1小时内完成实验，否则影响测定结果，因为红细胞中的还原酶可使高铁血红蛋白逐渐还原，使结果降低。但可放-20℃以下冷冻保存，如果血样较多，可将全血分成几小管，每次测试可取其一小管，每次测试可取其一小管，余下各管仍保存-20℃以下以备重复测试，其结果不受影响。

②、本实验可用双波长分光光度计测定，可同时测定602nm处及630nm处吸光度值，进行计算。也可用单波长分光光度计测定，可以先测定各管630nm处吸光度值，然后再测各管602nm处吸光度值。但一定要注意各管的编号不要弄错。

③如果实验室分光光度计没有双波长扫描功能，可以不做标准曲线，直接用本实验室数据。R与r均为常数，R=1.81;r=0.14

4所用器皿要干净。