己糖激酶（HK）活性检测试剂盒说明书
时间：2021-06-03 阅读：431
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南京信帆生物技术有限公司 -
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己糖激酶(HK)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
规格：50T/48S
产品内容：
提取液：液体 60mL× 1
瓶，4℃保存；
试剂一：液体 30mL× 1
瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂× 1 瓶，4℃保存； 临用前加入 30mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂 4℃保
存一周；
试剂三：液体 5 mL× 1 瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×1 支，- 20℃保存，用时每支加 4mL 双蒸水充分溶解备用，用不完的试剂 4℃保
存一周；
试剂五：粉剂×1 支，- 20℃保存；用时每支加 2mL 双蒸水充分溶解备用，用不完的试剂 4℃保
存一周；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；用时每支加 250μL 试剂一和 250μL 蒸馏水充分溶解备用，用
不完的试剂 4℃保存一周；
产品说明：
HK 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶，催
化葡萄糖转化为 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。
HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成
NADPH ，NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。
试验中所需的仪器和试剂：
紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸
馏水。
操作步骤：
一、样品测定的准备：
1.
细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：
提取液体积（mL）为 500-1000:1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破
碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），8000g 4℃离心 10min，
取上清，置冰上待测。
2.
组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1:5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入
1mL 提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3.
血清（浆）样品：直接检测。
二、测定操作：
1. 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。第 2页，共 2 页
2.将试剂一、二、三、四和五置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）预热 10min。
3.加样表
试剂名称(μL) 测定管
试剂一 400
试剂二 400
试剂三 80
试剂四 80
试剂五 40
试剂六 8
样本 30
将上述试剂按顺序加入 1mL 石英比色皿中，立即混匀，加样本的同时开始计时，在 340nm 波长下
记录 20 秒时的初始吸光度 A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃
（其它物种）水浴或恒温箱中，准确反应 5 分钟；迅速取出比色皿并擦干，340 nm 下比色，记录 5
分 20 秒时的吸光度 A2，计算ΔA=A2-A1。
注意事项：
1.如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三、四、五、六按比例配成混合液，预热 10min。
2.比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3.zui好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4.不同匀浆组织中 HK 活力不一样，做正式试验之前请做 1- 2 只预试，若ΔA> 0.5，则说明组织
活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩
短反应时间至 2min，使ΔA< 0.5，以提高检测灵敏度。
HK 活性计算：
1、 血清（浆）HK 活力的计算：
单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK（U/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=1113×ΔA
2、 组织、细菌或细胞中 HK 活力计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK（U/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1113×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK（U/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=1113×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK（U/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.226×ΔA
V 反总：反应体系总体积，1.038×10-3 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：
比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时
间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。